张鹏
[摘要]体细胞核移植这是近年来人类在细胞生物学及发育生物学范畴获得的最巨大的成果之一，他的成功标明动物体细胞的分解是可逆的。可是体细胞核移植的根底理论以及技能研讨现在还有许多薄缺陷，存在着克隆成功率较低一级问题，在必定程度上约束了它的开展。本研讨依据近年体细胞核移植技能的研讨状况，对使用这项技能进行克隆的首要进程、该技能在生物学、医学等范畴的使用远景以及现在仍需战胜的一些问题作一总述。
[关键词]体细胞；核移植；克隆；表观遗传重构
[中图分类号]Q819 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）05-40-04
一向以来研讨人员普遍以为只要经过卵子和精子彼此结合构成受精卵，跟着受精卵的不断分解，终究才干发育成为一个新的生命，但在这个进程中，受精卵细胞一起也将逐步地失掉其发育成为完好子孙的才干，把受精卵细胞具有发育成为完好个别的才干称为全能性。体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技能的成功归因于人们对细胞全能性的逐步知道。核移植（NT）就是将动物的体细胞或许前期胚胎卵裂球的细胞核，移植进经去核的发育老练的卵母细胞的胞质中或受精卵中，得到重构的卵母细胞，然后经过从头激活，康复其细胞割裂及分解，然后促使其发育成为与供体细胞的基因型彻底相同的子代，这一技能也可称为体细胞克隆技能。体细胞核移植技能最早是由德国的胚胎学家Spemann 1938年提出的，他起先提出这个理论，首要是为了研讨细胞核全能性的机制以及在胚胎发育的进程中细胞质与细胞核的彼此效果机理。直到1952年Briggs和King依照他的理论，初次成功地进行核移植试验，他们首先将非洲爪蟾的卵子去除其细胞核，然后向其间移植进其囊胚细胞核，然后得到了正常的子孙。跟着胚胎工程技能的不断进步，人们先后以不同动物的胚胎细胞等作为供体，不断成功地培养出了各种克隆动物，如克隆羊、克隆牛、克隆猪、克隆小鼠以及克隆家兔等。其间最具有标志含义的是1997年Roslin、研讨所的Wilmut等，初次在世界上报导了他们使用体细胞核移植技能，用老练绵羊的体细胞（乳腺上皮细胞）作为核供体，成功地克隆出“多莉”羊，一下在全世界掀起了轩然大波。这一试验充沛证明了高度分解的体细胞依然具有全能性，人们可以使用体细胞，经过体细胞移植技能获得基因型与供体细胞基因型根本相同的子代个别。成为了生物学以及遗传学开展史上一个重要的里程碑事情。家兔是生物医学研讨中最常用的试验动物之一。使用体细胞核移植技能出产克隆兔子是现在研讨的热门，在生物医学范畴具有非常诱人的使用远景。而家兔被以为是使用体细胞核移植技能难以成功克隆的哺乳动物之一，直到2002年法国学者Patrick Chesne等用卵丘细胞作为核供体初次成功克隆了家兔，突破了家兔难以成功克隆的关键问题，为扩展家兔在生物医学方面的使用研讨供给了办法。使用这项技能，2006年我国学者李善刚博士使用成纤维细胞作为核供体成功地培养出克隆家兔，在此根底上他又进一步将转基因技能与体细胞核移植技能结合起来，成功培养出了表达绿色荧光蛋白的克隆兔，将该项技能面向新的高度。
1体细胞核移植的首要办法
详细来讲，体细胞核移植技能首要包含受体细胞的去核、核供体细胞的预备与挑选、细胞周期的调控、细胞交融、重组胚胎细胞的激活以及培养等进程。
1.1受体细胞的挑选
在哺乳动物体细胞核移植的试验中，可以作为受体的细胞首要有以下三种：（1）去核的受精卯；（2）去核的MⅡ期老练卵母细胞；（3）去核的前期胚胎细胞，其间MⅡ期卵母细胞是现在选用较多的核移植受体细胞，因为在这个时期，一方面该细胞体积较大，便于显微操作；另一方面重组胚胎所需求的各种细胞因子在MⅡ卵母细胞质中均存在，而且细胞营养成分足够。在细胞割裂进程中，结合在DNA上的各种细胞因子如转录因子等从DNA螺旋轴上脱离下来，与此一起胞质中的许多重组因子即可与DNA螺旋轴结合，然后促进基因重组的发作。别的一方面，因为挑选适宜卵龄的卵母细胞作为胞质受体，对体细胞核移植是否可以成功发作巨大的影响，故细胞培养的时刻也特别重要，试验中一般多挑选培养40～44h，传代4～6代的卵母细胞作为受体细胞。因为许多的试验证明，传代越多重组胚的囊胚率也越多。
1.2受体细胞去核的办法
先要对受体细胞进行去核，才干进行供体核的移植。受体细胞去核有必要彻底，假如去核不彻底，一方面或许导致重组的胚胎细胞染色体构成非整倍体或多倍体然后使克隆直接失利，另一方面也或许使卵母细胞发作反常割裂进而发育受阻甚至可以导致胚胎的前期逝世然后使克隆终究失利。所以是否彻底使卵母细胞去核，是确保核移植所构成的新的胚胎细胞能否发育成为正常个别的前提条件。为了削减试验中的搅扰要素，可以经过缩短体外操作的时刻并快速而精确的去除受体细胞核以防止孤雌发育。大体上受体细胞去核的办法可以分为两种办法，即化学去核法和机械去核法。详细有以下几种操作办法（1）盲吸法：这一办法的长处是不必借助于其他的化学物质，但此法消耗时刻较长、易影响细胞质空间结构故对卵母细胞危害比较严重，所以技能要求较高，不同动物去核率相差也较大，使用较少；（2）半卵法：这个办法是使用特制的卵母细胞切开刀，将卵母细胞切开成为两个半卵，然后丢掉含有极体的那一半半卵细胞，用两个不含极体的半卵细胞与供体细胞核进行交融，构建核移植胚胎。（3）化学试剂去核法：这种办法的原理是使用蔗糖或许脱羰秋水仙碱等化学试剂的效果，使受体细胞可以自行排出第二极体，然后完成去核的意图，但现在还不清楚化学试剂是否对受体细胞形成危害；（4）揉捏法及点压法：此两种办法均是使用固定管固定住细胞，使细胞染色体坐落特定方位，然后揉捏通明带，用去核针取出榜首极体，再用荧光染料Hoechest33342染色后调查其去核率。点压法是揉捏法的改善办法，长处是对卵母细胞胞质的危害较小，在去核操作的进程中不必更换去核针，节省了时刻，有用的提高了去核功率；（5）纺锤体勘探技能：此法去除细胞核的办法是将卵母细胞放置于Spindle-view偏振光体系的倒置显微镜下，受体卵母细胞的纺锤体区域较其它部位亮堂，然后清楚显现其染色体方位，然后再用去核针经过显微镜下操作去核，以利于去核的操作精确彻底。（6）通明带胀大辅佐去核法：此法是先用去核针吸入适量操作液后稍施正压，使吸入的操作液陡峭流出，推进去核管，使通明带逐步胀大，然后用去核针将细胞核取出，此法的长处是缩短了去核操作的时刻而且显著地提高了去核操作后卵母细胞的生存率。（7）离心去核法：这个办法的原理是依据细胞质的密度小于细胞核，经过离心的办法将没有通明带的细胞核甩向一侧进而脱离卵母细胞。该办法的缺陷是有必要去除通明带，不利于之后核移植胚胎的发育。
1.3供体细胞挑选与核的移植
试验中可用于核供体的细胞许多，首要有胚胎干细胞（ES细胞）、卵丘细胞、颗粒细胞、睾丸支柱细胞、精子细胞、乳腺细胞、神经细胞以及成纤维细胞等，其间最首要的是两种：一是生殖细胞如卵丘细胞，二是胎儿或成年成纤维细胞。影响核移植胜败的一个重要要素是受体与供体细胞的细胞周期同步化发育，前期的研讨以为要使体细胞核移植成功必需使供体细胞处于GO期，获得GO期细胞首要是经过两种办法：挑选细胞类型或许人工诱导的办法。Inoue等研讨人员在小鼠的核移植试验中发现，移植的功率较大的遭到供体细胞的细胞类型以及其基因型的影响。近年来许多科研人员经过试验发现把没有经过休眠诱导的处于细胞周期中G1期、G2期以至于M期的细胞作为供体细胞进行核移植也可以获得成功。将供体细胞核移植进入受体细胞的常用办法首要可分为交融法以及打针法两类。其间交融法中现在最常用的是电交融的办法，这是因为电交融的办法具有细胞危害较小、可重复性好而且交融的效果较好等显着的长处，所以逐步被宽广的研讨人员所使用。电交融办法的原理是经过细胞在强电场短时刻的效果下，使细胞膜发作一过性的击穿，当电流使两个相邻的细胞膜触摸的区域发作击穿时，两边的细胞膜就可以在击穿的瞬间发作触摸并交融成为一个细胞。打针法一般分为通明带下打针和胞质内打针。通明带下打针是把整个供核细胞打针至受体细胞卵周隙，这就需求在打针后还需使供体细胞与受体细胞进行交融。胞质内打针一般是用压电一陶瓷微打针体系，直接把供体核注入胞质内。
1.4卵母细胞的激活
因为缺少了受精这一进程，在以老练的卵母细胞作为受体的核移植试验中，缺少了天然受精进程中受精卵的激活进程，所以有必要进行人工激活核移植后重构的卵母细胞然后促使其进一步分解发育。依据激活时期的不同，可分为移核前激活、移核时激活、移核后激活三种不同的时期。使卵母细胞激活的办法可以分为化学或许物理影响的办法两类。激活办法现在使用较多的有钙离子载体A23187激活和离子霉素激活、乙醇激活、蛋白质组成抑制剂激活、氯化锶激活、精子提取物激活、蛋白质磷酸化抑制剂激活以及电脉冲激活、联合激活等。尽管卵母细胞可以被以上的各种化学物质以及物理影响的办法激活，可是却不可防止地在激活的一起也形成受体细胞必定程度的危害，影响胚胎的发育。所以，是否可以赶快地探究出对卵母细胞危害较小而且激活功率高的激活办法对体细胞核移植技能终究能否成功尤为重要。
2体细胞核移植技能的使用远景
体细胞核移植技能作为细胞生物学及发育生物学范畴获得的最巨大的成果之一，使用远景必定是特别宽广的甚至是咱们一时无法估量的！其潜在的经济效益是非常巨大的，跟着这项技能的不断开展、逐步完善，必将带来生物学以及医学范畴的一场深入革新。这项技能在生物学方面如在维护濒危动植物物种、新物种的培养、优秀畜种培养以及转基因动植物出产方面远景非常宽广。别的，这项技能在医疗卫生范畴相同具有巨大的使用潜力和开展远景。尤其在医疗卫生范畴，或许为机体危害修正、器官移植甚至遗传性疾病、晚年性疾病的医治等打下坚实的根底，有着不可估量的效果，所以值得科研人员继续重视并为体细胞核移植技能的不断完善开展支付不懈的尽力。
3现在存在的问题
自从1997年初次报导体细胞核移植克隆羊获得成功以来，尽管现在科研人员经过体细胞核移植克隆动物现已获得了不少的发展，可是依然存在许多问题，仍缺少重大突破，比方核移植成功的整体功率仍较低、核移植的胚胎流产率依然较高以及胚胎发育反常如“巨胎症”等问题，一向困扰着宽广的科研人员。有研讨人员在试验中发现，在以卵母细胞作为受体的核移植小鼠的重构胚胎中，其间90%的染色体结构是正常的，这就阐明这些染色体结构正常的核移植小鼠的基因组应该也是正常的，所以他们估测重构胚胎发育反常绝大部分的原因或许是因为表观遗传重构的过错形成核移植胚胎的反常。表观遗传重构过错首要体现在这几个方面：X染色体失活，基因组印迹，组蛋白乙酰化，DNA甲基化，端粒与端粒酶长度反常等。近些年来，越来越多的体细胞核移植相关试验逐步证明了核移植中表观遗传重构的过错形成核移植胚胎反常这一理论的正确性。尽管当时核移植技能越来越老练，可是研讨人员对形成这种过错的原因以及其效果的机制仍未彻底清楚。各种原因使得核移植的成功率现在依然较低（<10%），即便胚胎可以正常发育，克隆动物可以出世，但出世后也经常出现各种反常。所以，进一步研讨核重构的分子机制，清晰现已高度分解的体细胞在卵母细胞中是怎么从头去分解的，以及核移植进程中怎么发作表观遗传重构等均是急需研讨人员不断进行探究的问题。
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