郭润民+刘畅+吴子君+姜佳美+吴斌+莫海亮+黄瑞娜+何松坚+李腾+闫海+李上海+游琼+吴铿
[摘要]意图挑选糖尿病心肌病患者血清差异表达的microRNA（miRNA），清晰miR-186-5p和miR-516a-5p在DCM发作开展中的效果和机制。办法挑选30例DCM患者为试验组，60例年纪适当的身体健康者为正常对照组，别离从两组随机选取3例作为研讨目标行microRNA芯片初筛差异表达miRNA，然后荧光定量qPCR验证这些miRNA的差异表达；在高糖诱导人AC16心肌细胞损害模型中，miR-186-5p和miR-516-5p的mimics和inhibitors别离干涉，调查对高糖引起的心肌细胞毒性的影响。成果microRNA芯片检测发现，糖尿病心肌病患者血清有51个差异表达的miRNA，经荧光定量qPCR验证为miR-186-5p、miR-516a-5p等8个差异表达miRNA；显着高表达的miR-516-5p和显着低表达的miR-186-5p介导了高糖所造成的心肌细胞毒性损害。定论糖尿病心肌病患者血清miRNA表达谱发作改动，有8个差异表达miRNA，miR-516a-5p和miR-186-5p或许参加糖尿病心肌病的心肌损害发病进程。
[关键词]microRNA；糖尿病；糖尿病心肌病；心肌损害
糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是独立于高血压、冠心病及心脏瓣膜病变的一种糖尿病心脏并发症，与糖尿病患者心血管疾病的高发作率及高病死率密切相关，越来越受到重视。糖毒性、脂毒性、氧化应激、线粒体功用障碍、内质网应激、心肌细胞凋亡、炎症等很多要素与DCM心肌损害密切相关，其间心肌细胞凋亡与炎症是DCM的首要发病机制之一，可是详细分子机制尚不清楚。
MicroRNA（miRNA）是22-24nt的一种非编码RNA，能经过碱基配对的办法特异性结合意图mRNA 3非编码区域负性调控其表达，在细胞分解、增殖、代谢、细胞凋亡和搬迁等生物学活动中发挥必定效果。新近研讨标明：MicroRNA在心脏纤维化、心律失常、心肌缺血、心衰等心脏疾病中具有重要效果；体表里试验研讨提示，MicroRNA表达反常或许在糖尿病心肌病发病机制中起到重要效果。
因而，为了深化说明DCM心肌损害的发病机理，为了清晰MicroRNA在DCM心肌损害中的详细效果与机制，本研讨拟选用microRNA芯片挑选DCM患者血清差异表达miRNA，而且荧光定量qPCR验证之；在高糖诱导人ACl6心肌细胞损害模型中，运用miRNA的mimics和inhibitors别离干涉，调查对高糖引起的心肌细胞毒性的影响。
1材料与办法
1.1材料
D-葡萄糖购自美国Sigma-Aldrich公司。胎牛血清（GIBICO），DMEM培育基（Hyclone），青链霉素（Hyclone），胰酶（Hyclone），PBS磷酸钾缓冲液（Hyclone）。miR-186-5p inhibitor、miR-186-5pmimics、miR-516a-5p inhibitor、miR-516a-5p mimics（广州锐博生物科技有限公司），miRcnte miRNA提取别离试剂盒、miRcute miRNA cDNA榜首链组成试剂盒、miRcnte miRNA荧光定量检测试剂盒（TIANGEN），Lipofectamine
3000 Transfection Reagent（Invitrogen公司），Opti-MEM培育基（Invitrogen公司），CCK-8（碧云天），30%丙烯酰胺混合溶液（碧云天）。人microRNA芯片版别为agilent V19。
1.2办法
1.2.1归入研讨的DCM患者一般材料与血液样本搜集挑选2012年6月～2015年7月期间在广东医学院隶属医院心血管内科住院的糖尿病心肌病患者30例，健康组60例。确诊规范参照以往文献报导，详细如下：（1）确诊糖尿病病程5年以上；（2）心脏扩展、心力衰竭、心绞痛或心律失常存在；（3）无冠状动脉巨细血管和微血管病变；（4）无其他原因的心肌病和心脏病。扫除规范如下：（1）急性脑梗死患者；（2）本身免疫性疾病；（3）运用激素或免疫按捺剂者；（4）发病前2周有炎症、感染性疾病；（5）依从性差不能完结相关目标测定的患者。本研讨经广东医学院隶属医院道德委员会审阅经过，参加本研讨的一切患者均签署了知情同意书。搜集DCM患者外周静脉血10mL，将其置于不含抗凝剂的搜集管中，室温静置30min后，4000r/min离心20min，离心留取上清低温冰箱保存备用。
1.2.2人MicroRNA芯片筛查与qPCR验证选用人microRNA芯片（agilent V19）筛查DCM患者和健康对照各3例血清microRNA表达差异；选用TIANGEN公司miRNA的别离提取试剂盒、cDNA榜首链组成试剂盒和荧光定量检测试剂盒行qPCR验证DCM患者血清与高糖处理心肌细胞差异表达microRNA。
1.2.3细胞培育与试验干涉人ACl6心肌细胞购自ATCC，10%胎牛血清的DMEM培育基置于5%C02、37℃的温箱中培育。试验分为两组：对照组，高糖组（35mmol/L葡萄糖效果24h或48h）。细胞株传代96孔板上，待其融合度约为50%～70%时，选用Lipofectamine 3000 Transfection Reagent转染miRNA mimics或inhibitor，于培育箱中孵育4h后替换培育基，24h后进行microRNA的检测。
1.2.4人AC16心肌细胞存活率的测定人AC16心肌细胞接种于96孔培育板中，当细胞生长到培育孔的约80%面积时，依据试验需求进行不同的处理，每个处理要素设3个复孔。停止培育后，每孔参加100μL CCK-8工作液，轻摇，37℃孵育2h，用Muhiskan MK3酶标仪（Thermo Fisher Scientific Inc，USA）（入=450mm）记载各孔的吸光度（OD）。取3孔OD值的平均数，按下列公式核算细胞存活率：细胞存活率（%）=处理组OD/对照组ODx100%，重复3次。
1.3统计学处理
统计剖析用SPSS15.0软件进行，计量材料以（x±s）标明，组间差异比较选用单要素方差剖析（one-way ANOVA），用LSD-t进行均数之间的比较，P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1MicroRNA芯片筛查DCM患者血清差异表达miRNA
为了探明糖尿病心肌病患者血清差异表达microRNA，首要运用microRNA芯片（agilent V19）挑选出了DCM患者血清51种差异表达microRNA（n=3），发现miR-516a-5p、hsa-miR-575和hsa-miR-630等显着升高，hsa-miR-144-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-30d-5p等显着下降。与健康对照组比较，P<0.05，fold change为差异倍数。见图1。
2.2荧光定量qRT-PCR验证DCM患者血清差异表达miRNA
为了验证microRNA芯片挑选成果，选用荧光定量qRT-PCR测定30例DCM患者和60例健康对照血清与高糖处理的ACl6心肌细胞microRNA表达，成果均显现：8种microRNA表达水平改变显着，hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-1 86-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-30d-5p下降显着（P<0.05），hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-575和hsa-miR-630添加显着（P<0.05），其间hsa-miR-186-5p下谐和hsa-miR-516a-5p添加最为显着。见图2。（A和B）经过qRT-PCR检测DCM患者（n=30）和正常人（n=60）血清中miR-516a-5p的表达水平。（C和D）经过qRT-PCR检测剖析不同处理的AC16细胞中miR-516a-5p的表达水平。与对照组比较（"P<0.05）。
2.3 miR-516a-5p和miR.m186-5p在高糖诱导心肌细胞损害中的效果
为了探求差异表达曲microRNA尤其是miR-516a-5p和miR-186-5p在DCM心肌损害中的效果，别离选用miR-516a-5p和miR-186-5p的mimics和inhibitors干涉，调查对高糖处理的AC16心肌细胞损害的影响。运用CCK-8测定AC16心肌细胞存活率，成果显现：miR-516a-5p的inhibitors和miR-186-5p的mimics能按捺高糖诱导的心肌细胞损害，另一方面，miR-516a-5p的mimics和miR-186-5p的inhibitors却能促进高糖诱导的心肌细胞损害。提示了表达失调的microRNA尤其是表达上调的miR-516a-5p和表达下调的miR-186-5p介导了DCM心肌损害的发病进程。见图3。
3评论
糖尿病心肌病是由糖尿病引起的心脏微血管病变以及心肌代谢紊乱所造成的的心肌细胞逝世，一般表现为心肌缩短和舒张功用下降乃至心力衰竭，独立于高血压、冠心病及心脏瓣膜病变等的首要心脏并发症之一。近年来，糖尿病的发病率逐年升高，DCM发病率和危害性极高，是糖尿病患者心血管疾病的高发作率及高病死率的首要病因，引起全世界的广泛重视。许多研讨标明：糖毒性、脂毒性、氧化应激、线粒体受损、心肌细胞凋亡、炎症等是DCM的发病要素，可是切当的分子机制不详。
MicroRNA（miRNA）是一种长度大约22-24nt的非编码RNA，已发现大约2500多种人类miRNA，这些miRNA至少调控30%以上的基因，在细胞分解、增殖、代谢、细胞凋亡、搬迁和坏死等生物进程中发挥重要效果。最近的研讨标明，microRNA在各种心脏疾病，包含心脏纤维化、心肌肥厚、心律失常、心肌缺血、心衰中发挥重要的效果。体表里试验研讨成果提示，microRNA表达反常在糖尿病心肌病心肌损害中或许起重要效果。因而，清晰DCM患者差异表达microRNA及其效果机制，关于DCM的发病机制、前期确诊和防治有重要含义。
本研讨microRNA芯片的成果显现：在DCM患者血清中有多种miRNA不同程度的上调或下调，8种microRNA表达水平改变显着，hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-30d-5p下降显着，hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-575和hsa-miR-630添加显着，其间hsa-miR-186-5p上谐和hsa-miR-516a-5p下降最为显着。本研讨及其他学者的研讨均证明，表达失调的miRNA在糖尿病患者心血管并发症的发作开展中有重要效果。此外，表达反常的miRNA在高糖诱导心肌细胞损害中相同有重要效果。
为了清晰这些表达显着反常的miRNA（尤其是hsa-miR-186-5p和hsa-miR-516a-5p）在DCM心肌损害中的详细效果与机制，本研讨选用33raMD-glucose处理人ACl6心肌细胞48 h模仿机体心脏糖毒性，进而别离运用miR-186-5p和miR-516a-5p inhibitor和mimics预处理，调查对高糖环境对心肌细胞存活率的影响。研讨成果显现：与体内miRNA芯片和qPCR验证成果相似的是，33mMD-glucose处理48h后，人AC16心肌细胞miR-186-5p水平也显着下降、miR-516a-5p表达水平显着添加；使用各自的inhibitor和mimics预处理后，miR-5 16a-5p的mimics、miR-186-5p的inhibitor的能促进高糖诱导的心肌细胞损害，miR-186-5p的mimics、miR-516a-5p的inhibitor的能按捺高糖诱导的心肌细胞损害。这些研讨成果提示：上调的miR-186-5p和下调的miR-516a-5p介导了DCM心肌损害，进一步验证了表达反常的miRNA在DCM心肌细胞损害中有重要效果。
综上所述，DCM患者血清中至少有8种microRNA表达水平改变显着，其间hsa-miR-186-5p上谐和hsa-miR-516a-5p下降最为显着，差异表达的miRNA（尤其是hsa-miR-186-5p和hsa-miR-516a-5p）在DCM心肌损害中有重要效果。独自或许联合筛查这些差异表达的miRNA在前期确诊和防治DCM中的效果有待深化研讨。
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