翁琳+杨俊发+柴晓宇+许飞
[摘要] 意图 开发一种能够快速、精确检测肺炎衣原体的检测办法。 办法 选用环介导等温核酸扩增技能（LAMP）对肺炎衣原体的特异性DNA保存片段进行扩增，将扩增的DNA与基因芯片进行杂交，查询是否可在芯片相应的区域呈现杂交信号。 成果 只要肺炎衣原体DNA经LAMP反响后呈现特异性的扩增条带，经LAMP扩增后的产品与基因芯片杂交，仅肺炎衣原体区域呈现杂交信号。 定论 LAMP技能联合基因芯片技能具有高度灵敏性、高度特异性的特色，可快速精确地检测肺炎衣原体。
[关键词] 环介导等温核酸扩增技能；基因芯片；肺炎衣原体；杂交
[中图分类号] R563.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）09（c）-0004-03
Application of LAMP combined with gene chip technology in detection of Chlamydia pneumoniae
WENG Lin1 YANG Jun-fa2 CHAI Xiao-yu2 XU Fei3▲
1.The Second People′s Hospital of Yichun City in Jiangxi Province，Yichun 336000，China；2.Medical College of Nanchang University，Nanchang 336000，China；3.Department of Respiratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 336000，China
[Abstract] Objective To invent a rapid and accurate method to detect Chlamydia pneumonia（CP）. Methods The specific DNA conservative segment of CP was amplified by using loop-mediated isothermal amplification（LAMP）.The amplified DNA and gene chip were hybridized.Whether the hybridization signal appearing or not in the corresponding region of the chip was observed. Results Only the amplified CP-DNA by LAMP appeared the specific amplification bands.After the LAMP sequence was hybridized with gene chip，only in the CP area appeared corresponding hybridization signal. Conclusion LAMP combined with gene chip technology have characteristics of high sensitivity，high specificity，can detect CP quickly and accurately.
[Key words] Loop-mediated isothermal amplification；Gene chip；Chlamydia pneumoniae；Hybridization
肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，CP）是社区取得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的一种致病菌，年老体弱、免疫力低下者简略感染，且易重复，不易控制。跟着我国老龄化的日益严重，CP所形成的肺炎的发病率及死亡率有上升趋势。前期清晰确诊病原菌非常重要，但现阶段临床上关于CP的检测还相对滞后，本研讨旨在开发一种能够快速、精确检测CP的办法。环介导等温核酸扩增技能（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新的核酸扩增办法，具有简洁、快速、高特异性好等长处[1-4]。基因芯片杂交技能能在面积较小的载体上一起检测多种病原菌，具有快速、精确、高通量等长处[5-6]。本研讨选用LAMP技能对CP的靶基因进行扩增，后将扩展产品与基因芯片杂交，然后完成对CP的特异性检测。
1 材料与办法
1.1 菌种规范DNA来历
CP-DNA由南昌大学榜首隶属医院呼吸内科研讨室自行制备及保存，而金黄色葡萄球菌、志贺菌、一般变形杆菌、大肠埃希菌、霍乱弧菌、枯草杆菌、沙门菌DNA均购买于北京美莱博医学科技有限公司。
1.2 首要试剂、仪器
试剂：2×PCR TaqMix（Tiangen Biotech）、BstDNA聚合酶（New England Biolabs公司）、引物（上海生工生物有限公司）、抽提液、杂交缓冲液、显色液、DNA Marker 500 bp。仪器：PCR仪（Biometra）、点样仪（Omni Grid100）、电泳仪（Bio Rad公司）、紫外成像体系（Alphalmager EC）、共聚集激光扫描仪（Gene Pix 4000B）。
1.3 引物及探针的规划与组成
依据GenBank发布的CP特异性基因片段——ompA基因，并依据此基因片段规划合理的引物和探针。引物及探针均购于上海生工生物工程有限公司，CP的特异引物序列见表1。
表1 CP的LAMP特异性引物序列
1.4 芯片制备
基因芯片由上海芯片国家工程研讨中心点制（图1），其检测原理是运用上述组成的探针与荧光符号的靶基因杂交，然后依据杂交信号强弱评判成果的一种定性检测。先将上述组成的探针稀释调整浓度至30 μmol/L，运用醛基化玻片进行点样，将每个样品点成4×4的矩阵，每个芯片上能够包容32个矩阵，点制好的芯片置于干燥箱中保存备用。阳性对照选用Poly（T）-Biotin，探针稀释液为空白对照组，无同源性的酵母基由于阴性对照。
图1 探针点样示意图
M.肺炎支原体；C.CP；L.嗜肺军团菌；P.阳性对照；N.阴性对照；B.空白对照
1.5 LAMP扩增及反响产品的检测
先将F3 4 μl、B3 4 μl、FIP 16 μl、BIP 16 μl、ddH2O 50 μl混合均匀制造CP引物，在各PCR管中参加CP引物（1 μl）、模板DNA（2 μl）、ddH2O（6.2 μl）、Bst酶（0.8 μl）混和均匀后置于PCR仪中，温度设置为80℃，时刻为10 min。将LAMP反响产品置于离心机中以12 000 r/min速度离心1 min，后将沉积产品放入1.5%琼脂糖凝胶中电泳25 min，于凝胶成像体系中成像。
1.6 芯片杂交
取每个LAMP反响产品10 μl与200 μl杂交缓冲液混合10 min（温度设置为98℃），当即转移至0℃环境5 min，最终转移至芯片反响区内，平铺均匀，设置温度为45℃，杂交3 h后进行芯片扫描，依据荧光信号强度的剖析成果。
1.7 灵敏性检测
取必定量CP-DNA并测定其浓度，先将DNA浓度调整到22.5 ng/μl，后走10倍梯度稀释（规模为10-1～10-10），各取1 μl CP-DNA进行LAMP扩增，运用电泳法检测各浓度的扩增倍数。
1.8 特异性检测
先对本研讨检测的CP-DNA和其他菌种DNA进行LAMP扩增，经过电泳法检测各反响产品的差异。后将各反响产品行基因芯片杂交，依据杂交信号的不同判别其特异性。
2 成果
2.1 LAMP检测CP特异性成果
仅CP-DNA经LAMP反响后呈现很多的焦磷酸镁盐白色沉积产品，经琼脂糖电泳后发生特有的阶梯状散布的扩增条带（图2），而金黄色葡萄球菌、志贺菌、一般变形杆菌、大肠埃希菌、霍乱弧菌、枯草杆菌、沙门菌DNALAMP扩增均无以上反响。
图2 CP的LAMP反响特异性成果
M.Marker（500 bp）；1.CP；2.金黄色葡萄球菌；3.志贺菌；4.一般变形杆菌；5.大肠埃希菌；6.霍乱弧菌；7.枯草杆菌；8.沙门菌；9.空白对照
2.2 LAMP检测CP灵敏性成果
LAMP办法在DNA稀释倍数为107情况下仍可见电泳反响成果，可见LAMP扩增核酸为107倍（图3）。
图3 CP的LAMP反响灵敏性成果
稀释后浓度1.22.5 ng/μl；2.22.5×10-1 ng/μl；3.22.5×10-2 ng/μl；4.22.5×10-3 ng/μl；5.22.5×10-4 ng/μl；6.22.5×10-5 ng/μl；7.22.5×10-6 ng/μl；8.22.5×10-7 ng/μl；9.22.5×10-8 ng/μl；10.22.5×10-9 ng/μl；M.Marker（500 bp）
2.3 CP杂交成果
只要CP组呈现相应的电泳信号，而其他对照组无反响成果（图2），阐明LAMP扩增CP-DNA的办法具有较高的特异性。将LAMP扩增产品与芯片杂交后，仅CP对应的方位呈现杂交信号，而其他方位无杂交信号（图4），提示芯片杂交技能相同具有高度特异性。
图4 CP杂交成果扫描图
3 评论
CP感染在世界各地的发病率有显着不同。我国流行病学查询显现，成人CAP患者中，CP感染显着高于肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）及嗜肺军团菌（Legionella pneumoniae，LP），感染率分别是28.1%、3.9%、5.2%[7]。有根底疾病的晚年患者简略感染CP，且并发肺炎病况较重，常需住院医治，乃至入住ICU。亚洲一项多中心研讨标明，CP感染入住ICU的份额较MP及LP显着增高，入住率分别为16.7%、1.9%、6.6%[8]。CP感染所形成的的CAP前期临床症状和体征多不典型。传统的血清学抗体查看多适应于回忆性确诊，细菌培育所需时刻较长，且培育条件严苛，不能前期辅导临床医治。PCR检测技能发展迅速，现在已有多重PCR、巢式PCR、实时荧光PCR等，能够精确地检测CP，但其对引物及设备等要求较高[9]。LAMP技能是在等温条件下运用4种特异性引物辨认靶基因的6个特定安稳区域后进行核酸扩增，只要靶基因6个特定区域与特异性引物正确辨认才干发动LAMP反响，反响过程中发生很多的焦磷酸根离子，与镁离子结合构成白色的焦磷酸镁根沉积[1]。依据沉积法、电泳法及荧光法检测上述反响产品，因而LAMP技能不只能够扩增靶基因，也能检测扩增产品；不只能辨别不同类型的病原菌，也能区别同一病原菌的各种亚型，具有高度特异性。相关于传统的PCR，LAMP技能具有恒温的长处，不会因改动反响温度而形成时刻糟蹋，且设备要求简略，故具有更简洁、经济、快速的特色。
LAMP技能尽管具有优势，但也有必定的缺点，LAMP技能选用多条引物扩增，引物间互补扩增可呈现假阳性，且惯例LAMP技能只能检测一二个基因。基因芯片是生物芯片的一种类型，是以已知的特定寡核苷酸片段或基因片段作为探针，与不知道序列核酸序列进行杂交的一种技能，具有快速、高效、高通量等特色。LAMP扩增技能与基因芯片杂交技能整合能够完成两者的优势互补，先经过LAMP反响扩增靶基因及对反响产品的开始检测，后使用基因芯片的荧光探针杂交技能对LAMP反响产品进一步检测，不只能够到达更高的灵敏性和特异性，还能一起完成对多个样本的检测。现在的联合技能有LAMP与微流控芯片整合的技能，LAMP与电化学基因芯片整合的技能等[10-11]。
总归，本研讨使用LAMP联合基因芯片技能为快速精确地检测衣原体供给了一种新的办法，其安稳性、规范化等问题需求经过更多的研讨去处理。
[参考文献]
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[11] Nakamura N，Ito K，Hashimoto M，et al.Development of mutisample detection system using a tag insertion primer and an electrochemical DNA chip[J].Anal Biochem，2011，419（2）：190-195.
（收稿日期：2014-08-11 本文修改：李亚聪）
总归，本研讨使用LAMP联合基因芯片技能为快速精确地检测衣原体供给了一种新的办法，其安稳性、规范化等问题需求经过更多的研讨去处理。
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（收稿日期：2014-08-11 本文修改：李亚聪）
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（收稿日期：2014-08-11 本文修改：李亚聪）
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