陈娟++++++张炎晶++++++苗燕++++++赵育芳++++++刘利平
[摘要] 意图 树立人胆囊癌裸鼠皮下移植瘤模型，并对其进行超声调查。 办法 培育GBC-SD细胞，将细胞浓度调至1×107/ml，取0.2 ml打针于裸鼠皮下。成瘤后作为瘤源，瘤块剪成约2 mm3的安排块，置入裸鼠皮下，待其成瘤。今后各代模型的瘤源均来自上一代模型，用相同的办法接种。记载瘤块成瘤率、成瘤时刻、成长特色。调查瘤块外观，并进行超声、解剖及病理调查。 成果 细胞打针法及安排块法可成功树立胆囊癌裸鼠移植瘤模型，成瘤率为100%；各代安排块法之间成瘤时刻差异无计算学含义（P>0.05）；二维超声丈量瘤体最大径与大体游标卡尺丈量差异有计算学含义（P<0.05）。 定论 将细胞打针法与安排块法结合，是一种抱负的树立人胆囊癌裸鼠移植瘤模型的试验办法。
[关键词] 胆囊癌；裸鼠；移植瘤；动物模型
[中图分类号] R735.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）02（b）-0004-04
Establishment of human gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model and its ultrasonic observation
CHEN Juan ZHANG Yan-jing MIAO Yan ZHAO Yu-fang LIU Li-ping▲
Department of Ultrasound，the First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China
[Abstract] Objective To establish the human gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model and to observe by ultrasound. Methods GBC-SD cells were cultured and the cell concentration was adjusted to 1×107/ml，of which 0.2 ml was subcutaneously injected to nude mouse.The cultivated tumor was selected as the tumor source and cut into tissue blocks of 2 mm3，which were then implanted into the subcutaneous tissue of nude mouse to cultivate tumor.The tumors of later generation were all cultivated from sources of tumors of the former generation by the same method.The tumor formation rate，time of tumor formation，and features of tumor formation were recorded.The appearance of tumor block was observed and ultrasonic，anatomical and pathological observations were conducted. Results The method of cell injection and tissue block implantation could successfully establish the gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model，with tumor formation rate of 100%.The tumor formation time of each generation showed no statistically significant difference （P>0.05）.The maximum diameter of tumor detected by ultrasound and vernier caliper showed statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion Combination of cell injection and tissue block implantation is a favorable method to establish the gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model.
[Key words] Gallbladder cancer；Nude mouse；Transplanted tumor；Animal model
胆囊癌是胆道体系恶性肿瘤中最常见的一种类型，占消化道恶性肿瘤的第5位[1]。近年来，胆囊癌的发病率有逐步增高的趋势，且前期原发性胆囊癌无特异性的临床表现，临床发现的胆囊癌多为中晚期，彻底治愈性切除率低，医治作用及预后差[2-4]。因而树立适合的动物模型是研讨胆囊癌体内成长、搬运机制的重要东西，对胆囊癌的前期确诊、医治及有用评价医治作用、预后等有深远含义。本研讨将GBC-SD细胞打针法和瘤安排块法结合，成功树立了裸鼠移植瘤模型，现报导如下。
1 材料与办法
1.1 细胞培育
GBC-SD人胆囊癌细胞购自我国科学院细胞库，细胞株从一位61岁的男性低分解胆囊癌患者中树立。细胞培育于含10%胎牛血清（杭州四季青公司），0.4%双抗的RPMI1640（Gibco公司）培育基中，置于培育箱中连续培育及传代，培育箱温度坚持在37℃，培育环境为5.0%CO2，1～2 d换液1次，细胞处于对数成长时刻时用胰酶消化后搜集，参加适量生理盐水调整细胞悬液浓度至1×107/ml，置于1 ml的EP管中备用。
1.2 试验动物
BALB/c裸鼠33只，购自常州卡文斯试验动物有限公司，鼠龄3～4周，雄性，体重16～18 g，养殖于山西医科大学试验动物中心，试验条件契合SPF要求，所用物品均经高压灭菌消毒。裸鼠置于恒温、恒湿、无菌、净化的屏障体系内养殖。
1.3 细胞打针行裸鼠皮下移植瘤模型的制备
随机取其间2只裸鼠，10 ml/kg 5%水合氯醛腹腔打针麻醉，碘伏消毒右前肢皮肤，用1 ml打针器汲取0.2 ml细胞悬液打针于右前肢皮下。调查裸鼠移植部位，了解肿瘤成长状况及成长速度。
1.4 安排块法行裸鼠皮下移植瘤模型的制备
细胞打针接种，皮下瘤块达到瘤规范（瘤块直径约1.0 cm）后，作为瘤源，无菌条件下取出瘤块，去除脂肪、坏死安排及纤维安排，取边际生机旺盛的安排用无菌生理盐水漂洗，眼科剪剪成约2 mm3的安排块放入盛有生理盐水的培育皿中备用。另取裸鼠7只，消毒双前肢下皮肤，用眼科剪剪开2～4 mm长的小口，将备好的小瘤块2～3块置入皮下，缝合皮肤，消毒切断周围，青霉素肌内打针3 d，种瘤3 d后拆线。调查裸鼠移植部位，了解肿瘤成长状况及成长速度。
待前一代裸鼠移植瘤达到瘤规范后，任选一只作为瘤源，用相同的安排块法进行下一轮接种传代，制备皮下移植瘤模型，第二代种瘤9只，18个瘤块，第三代种瘤15只，30个瘤块。今后各代模型的瘤源均来自上一代模型。
1.5 瘤块的超声查看
外观游标卡尺所测最大径达1 cm后，超声调查其特色。用GE Logic E9超声确诊仪，ML6～15线阵宽频探头调查，试验中显像深度根本坚持共同，图画增益、声压、机械指数均坚持不变。
1.6调查项目
1.6.1 裸鼠移植瘤成长状况及成长速度 调查裸鼠的健康状况、一般状况及皮下肿瘤构成状况，种瘤后每2天用数字游标卡尺丈量皮下瘤的最大径。记载不同成瘤办法的成瘤时刻及成瘤率。
1.6.2 瘤块超声 惯例超声扫查瘤块，调查记载瘤块巨细、回声及血流特征。
1.6.3 瘤块的病理学查看 试验完结后处死裸鼠，完好切取肿瘤安排，标本惯例10%甲醛固定，脱水、白腊包埋、切片，行HE染色，光镜下调查。
1.7 计算学剖析
选用计算软件SPSS 16.0对试验数据进行剖析，计量材料以均数±规范差（x±s）表明，多组独立样本的比较选用方差剖析，单样本均数的比较选用t查验，以P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 成瘤率的计算状况
人胆囊癌细胞GBC-SD接种裸鼠2只，均成瘤，成瘤率100%。第一代安排块法接种裸鼠7只，每只2个，7只裸鼠14个均成瘤，成瘤率为100%。第二代安排块法接种裸鼠9只（18个），其间一只裸鼠因试验忽略漏喂水而逝世，除掉试验，其他8只（16个）裸鼠均成瘤，成瘤率为100%。第三代安排块法接种裸鼠15只（30个），均成瘤，成瘤率为100%。
2.2 瘤体成长特色及成瘤时刻
细胞打针组及瘤安排块组种瘤6 d后，接种部位连续开端呈现瘤块。后瘤块缓慢增大，瘤块最大径达4 mm后，成长速度逐步加快。
细胞打针组皮下瘤块最大径达1 cm的时刻为（16.5±0.7）d。第一代安排块法组、第二代安排块法组、第三代安排块法组皮下瘤块最大径达1 cm的时刻分别为（17.1±2.1）、（17.5±1.9）、（17.6±1.6）d。安排块法各代之间瘤块最大径达1 cm的时刻，差异无计算学含义（P>0.05）。
2.3瘤体调查
2.3.1 外观调查 瘤体质硬，固定于肢体皮下，胀大性成长，呈类球形，与周围安排分界清楚，易剥离，晚期部分瘤体处皮肤可见破溃。
2.3.2 超声调查 瘤体呈低回声，内部回声均匀或不均匀，与周围皮肤分界清楚，跟着瘤块增大，中心可呈无回声。五颜六色多普勒血流显像可见部分瘤块内有点状、线状或分支状五颜六色血流信号（图1）。二维超声所测瘤块最大径为（0.88±0.09）cm，小于外观游标卡尺所测值1 cm，差异有计算学含义（P<0.05）。
图1 安排块法瘤块超声调查
2.3.3 解剖调查 瘤体苍白，质硬，切开后，中心赤色质软，有坏死安排，周围是活泼的肿瘤细胞层，肿瘤的外层包裹有包膜（图2）。
图2 安排块法瘤块解剖调查
2.4 病理切片调查
瘤块病理切片HE染色细胞形状契合人胆囊癌的特征。瘤体安排内细胞摆放紊乱，内有很多分解程度低，形状不规则、巨细不一，胞质丰厚的深染巨核细胞，细胞核异形性显着，一起可见少数核分裂象及多核瘤巨细胞（图3）。
图3 瘤块病理切片（HE，×400）
3 评论
原发性胆囊癌是胆道体系最常见的恶性病变，占消化道恶性肿瘤的第5位[1]，胆囊癌恶性程度高，侵袭能力强，手术切除率低，辅佐医治作用欠安，预后较差[2]，因而值得深入研讨。动物肿瘤模型为胆囊癌的研讨供给了重要渠道。
1969年Rygaard等[5]初次将人结肠癌安排接种于裸鼠皮下，成功树立了裸鼠皮下移植瘤模型后，裸鼠便被广泛地使用于人类肿瘤的基础理论和临床医治的试验性研讨中。因为裸鼠移植瘤在安排病理形状学、生物学特性及对化疗药物的敏感性等方面与其原发的肿瘤类似，因而，裸鼠移植瘤模型是现在肿瘤学研讨中较为抱负的动物模型[6]。
现在常用的皮下移植瘤建模办法是细胞打针法和瘤安排块法[7]。本研讨将两种办法结合，大大简化了移植瘤模型的制备进程，合适长时刻传代。
本研讨首先将体外培育的GBC-SD细胞悬液打针到裸鼠皮下，制备皮下移植瘤模型。同许多学者研讨[8-10]成果共同：打针法皮下移植瘤模型成瘤率高，细胞致瘤性强，打针较小的瘤细胞量即可致瘤，肿瘤成长平稳，生存期安稳。但细胞打针法成瘤时刻相对较长，细胞体外培育时复苏、传代、冻存进程中都极易污染，培育周期长，比较贵重，不合适长时刻传代[11]。
传统的安排块法瘤源多取自手术切除的存活胆囊癌安排，但试验本钱较高，试验条件要求较高，选材难度较大。本研讨细胞打针法成瘤后作为瘤源进行裸鼠异体移植和传代，避免了以上的缺乏，简化了移植瘤模型的制备。别的瘤块鼠间异体移植时成瘤安稳，成瘤率达100%。徐鸿绪[12]的研讨用细胞打针法结合瘤安排块法成功树立了前列腺癌裸鼠移植瘤模型，裸鼠移植瘤成功率可达100%。洪国斌等[13]用此法成功制备了肝癌裸鼠移植瘤模型，肿瘤造模成功率为93.75%。汤静[14]用此法成功制备了肝癌裸鼠移植瘤模型，肿瘤造模成功率为100%。进步瘤安排块法成瘤率的办法有：瘤源的选材赶快完结；欲接种的肿瘤安排制备成适合巨细的瘤安排块；在裸鼠养殖及各种操作进程中严厉遵从无菌准则等。
现在关于移植瘤建模办法的研讨首要会集在讨论建模成瘤率及移植瘤与原肿瘤共同性的问题[15]。本研讨两种办法成瘤率皆高，简直可达100%，病理切片HE染色成果显现两种办法在安排学形状上并无差异，能够推论在相同的微环境下经过细胞悬液所树立的模型和经过安排块树立的模型安排学形状及生物学特性相同无差异。
总归，将细胞打针法与安排块法结合，移植瘤能在裸鼠体内继续增殖和长时刻传代，且移植瘤的形状与原人体肿瘤坚持共同，是一种抱负的树立人胆囊癌裸鼠移植瘤模型的试验办法，可为后续胆囊癌的研讨供给杰出的试验渠道。
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（收稿日期：2015-12-02 本文修改：卫 轲）
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