韩瑞杰+王小花+张哲+李桂芹+刘海峰
[摘要]纤维化是导致器官功用缓慢衰竭的首要原因，严重损害人类健康。现在临床上仍缺少可有用反转纤维化的药物。近年来，跟着对纤维化发作机制知道的深化及分子生物技能的不断开展，基因工程药物在抗纤维化医治中日益发挥重要效果。
[要害词]抗纤维化；基因生物工程药物；现状
[中图分类号] R453 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）12（b）-0018-04
Current situation of research on genetic engineering drugs
HAN Rui-jie1，2 WANG Xiao-hua3 ZHANG Zhe1 LI Gui-qin2 LIU Hai-feng1
1.Medical Research Center，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China；2.Hongqi Hospital Affliatied to Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China；3.College of Basic Medical of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China
[Abstract]Fibrosis is the main cause of chronic organ failure，which is harmful to human beings.There still no effective drugs which can reverse fibrosis in clinic.Recently，with the research on pathogenesis of fibrosis and the development of molecular biological technology，genetic engineering drugs play an important role in anti-fibrosis therapy.
[Key words]Anti-fibrosis；Genetic engineering drugs；Gurrent situation
器官纖维化已成为当今损害人体健康的首要疾病之一，它是以细胞外基质过度堆积为特征的一种病理状况，触及多种细胞因子、炎症介质和蛋白成分表达的改动，首要与细胞外基质的生成及降解失衡有关[1]。纤维化的继续开展可致器官结构损坏和功用衰竭，严重威胁人类生命健康。纤维化疾病可累及全身多个器官及体系，包含体系性硬化、移植物抗宿主硬皮病、特发性肺纤维化、肝硬化、开展性肾病、心血管纤维化等[2]。尽管现在抗纤维化的药物（细胞因子拮抗剂、胶原生物组成按捺剂和促进胶原分化的抗纤维化药物）取得杰出的效果，但因为其制备周期长、造价贵重等缺陷而约束其临床运用。近年来，跟着基因工程技能取得巨大开展，以蛋白质的结构与功用间关系为根底，经过缜密的分子规划，进而运用基因工程技能来进步重组蛋白的活性，改进产品安稳性，进步生物使费用，延伸其在体内的半衰期以及下降制品的免疫原性等长处把蛋白质改形成为符合人类需求的蛋白质，已成为新药研制的新宠。基因工程亦称遗传工程，即运用DNA重组技能，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源性DNA（意图基因）和载体DNA重组，最终将重组体转入宿主细胞，使外源性基因DNA在宿主细胞内随细胞的增殖而增殖。
1 Napsin A基因工程药物
Napsin A是一种近年发现的新的天门冬氨酸蛋白酶，首要表达于Ⅱ型肺泡和肾近端小管细胞中，被公认为是肺腺癌的标志物[3]。Napsin A基因含有5个外显子，其转录产品由1263 bp构成，A编码420个氨基酸的蛋白质。Napsin A相对分子量是35 kDa，等电点为5.29，其一级结构是由4部分构成，24个氨基酸残基组成的信号肽，40个氨基酸残基组成的前肽区，336个残基组成的功用区和18个残基组成的C结尾[4]，但近年来研讨标明其表达水平与肺纤维化密切相关。Samukawa等[5]研讨标明，在肺纤维化的患者血清中Napsin A显着添加，提示管血清中Napsin A可作为临床确诊肺纤维化的标志物。Zheng等[6]选用搬运质粒、辅佐质粒和包膜表达质粒三个部分构建的慢病毒体系PLJM1-Napsin A，将其转染至Ⅱ型肺泡上皮细胞A549的肺纤维化模型中，成果发现，转染Napsin A基因的Ⅱ型肺泡上皮细胞A549在上皮-间质转化过程中的增殖才能显着遭到按捺，一起，上皮细胞的标志物E-cadherin表达水平下降而间充质细胞的标志物Fibronectin表达添加，可见Napsin A基因工程制品可以有用医治肺纤维化。
2 细胞球蛋白基因工程药物
细胞球蛋白（Cytoglobin）归于肝星状细胞激活相关蛋白，表达于各种安排的成纤维细胞中。Stone等[7]研讨标明，细胞外基质蛋白经过依赖于FAK信号通路来调控Cytoglobin的表达，进而影响纤维化的发作开展；进一步研讨标明Cytoglobin可以负向调控肝星状细胞的活化。Mimura等[8]研讨标明，过表达Cytoglobin能改进安排的病理变化，保存肾功用和推迟纤维化的发作；一起标明Cytoglobin的这种维护效果与硝基酪氨酸的堆积和尿中羟基脱氧鸟苷的分泌密切相关。He等[9]运用基因工程的办法制备Cytoglobin，研讨发现，与对照组比较，在硫代乙酰胺诱导的肝纤维化SD大鼠模型中，Cytoglobin处理的SD大鼠纤维化程度显着减轻，首要表现在反映肝纤维化等级的重要目标（血浆天冬氨酸氨基搬运酶、透明质酸、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白及肝脏羟脯氨酸）的含量均显着下降；一起按捺大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖和促进其凋亡；进一步研讨标明，Cytoglobin按捺B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）和促进Bax蛋白表达，进而添加了Bax/Bcl-2的份额，提示Cytoglobin经过诱导细胞凋亡途径来在体表里试验中到达抗肝纤维化的意图，可见Cytoglobin基因工程药物代表一种新颖的抗纤维化药物。
3 肝细胞成长因子基因工程药物
肝细胞成长因子（HGF）是酪氨酸激酶外表配体受体（c-Met）的有用激动剂，它与涣散因子为同一分子，是重要的抗纤维化因子[10]，可介导细胞的成长、存活和运动，对安排的再生发挥有重要效果，但其本身结构杂乱，运用哺乳动物表达体系出产重组蛋白的翻译后润饰也很杂乱，故哺乳动物细胞培养法制取重组人肝细胞成长因子（rhHGF）产值遭到约束并且本钱贵重。Sonnenberg等[11]运用組合蛋白工程法，运用酵母菌体系大量出产出HGF工程片段（HGF-f）作为rhHGF的代替物，这种激动剂二聚体在体外试验显现出与rhHGF相似的功用。研讨发现，与对照组比较，过表达HGF-f的心脏细胞中上调基质金属蛋白酶（MMP）-1及MMP-9的mRNA表达，一起下调转化出产因子-β1（TGF-β1）的表达。MMP-1和MMP-9在多种安排中能降解细胞外基质来减轻纤维化，而TGF-β1在超越15种安排中能诱导细胞外基质的表达来添加纤维化，提示HGF对纤维化疾病具有医治效果。重组蛋白HGF本身不安稳，能敏捷被广泛表达在肝细胞外表和细胞外基质中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）螯合，这种天然分子相同趋向于聚合。这些特征约束了活化的成长因子的数量，一起也约束了其在临床上的运用。HGF包含2条多肽链和6个结构域：N端结构域（N）、4个具有α重链的环状结构域（K1～K4）和一个具有β轻链的丝氨酸蛋白酶同源结构域，HGF对HSPG有两个结合位点：高亲和力的在N结构域、低亲和力的在K1结构域。NK1是HGF天然生成的剪接变体，编码N结构域和K1结构域，Ross等[12]经过蛋白质工程手法生成了NK1的骤变体1 K1（K132E∶R134E），它的K1结构域HSPG低亲和力结合位点经过Lys132和Arg134的反相电荷骤变被损坏掉，这改动了K1外表的静息电位。研讨显现1 K1工程蛋白和天然HGF蛋白具有相似的促人初级肝细胞增生和抗凋亡的功用，并且1 K1具有更好的溶液安稳性，在Balb/c小鼠4周的CCl4诱导肝纤维化期间内给予1 K1直至小鼠被处死，天狼星红染色切片的成果标明，与对照组比较，1 K1组肝纤维化显着削减了19%，ALT水平削减了30%。以上研讨标明，肝细胞成长因子工程药物具有抗纤维化的功用。
4转化成长因子Ⅱ型受体TβRⅡ基因工程药物
转化成长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），包含TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，在纤维化的发作开展中发挥要害的效果，被公认为是迄今发现的最强的诱导肝星状细胞增殖、活化、搬迁和细胞外基质（ECM）堆积的促进剂，其间TGF-β1在纤维化中起首要效果[13]。TGF-β1参加细胞的成长分化，安排器官的胚胎发育，损害后修正等多种生物学效应，特别是对ECM的堆积和按捺MMPs起着重要的效果[14-15]。TGF-β的生物学功用是经过与其细胞膜上的受体相结合来完成的。TGF-β有2个首要的细胞膜受体：TGF-β Ⅰ型受体（TβRⅠ）和TGF-β Ⅱ型受体（TβRⅡ）均为穿膜的丝氨酸/苏氨酸激酶，是信号传导所必需的，两者结构相似，均包含膜外区域、单跨膜区域、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和胞质区域。其间TβRⅡ可独自与TGF-β结合，而TβRⅠ必须在TβRⅡ与TGF-β结合的条件下才能与TGF-β结合[16]，因而，TGF-β的生物学功用取决于TGF-β的活化和TβRⅡ的存在[17]。阻断TGF-β信号传导通路，便可有用的按捺过表达的TGF-β所引发的纤维化。Liu等[18]运用腺病毒载体转染介导游离型全长TβRⅡ基因至靶细胞，其与野生型的TβRⅡ竞赛结合TGF-β1，导致部分野生型受体无法结合到TGF-β1而到达按捺TGF-β1功用的意图。Chu等[19]研讨标明，经过挑选截短型的TβRⅡ，能与野生型的TβRⅡ竞赛结合纤维化过程中发作的TGF-β1，进一步按捺纤维化细胞的增殖和细胞外基质蛋白的表达。Liu等[20]研讨标明，经过基因克隆手法扩增截短型的TβRⅡ，经过原核表达制备截短型TβRⅡ，效果于纤维化的细胞中，不光按捺纤维化细胞的增殖，并且按捺纤维化相关的胶原蛋白的表达。郁子扬等[21]构建了安稳表达大鼠sTβRⅡ-IFNγ（sTβRⅡ-IFNγ）交融蛋白的真核表达体系，选用pSecTag2/TβRⅡ-IFNγ真核表达质粒直接肌肉注射法基因医治，其显着削减二甲基亚硝胺（DMN）诱导的大鼠HSC活化，削减α-SMA和ECM表达，减轻肝纤维化程度，且其效果较独自sTβRⅡ或IFNγ表达质粒更显着。以上研讨标明，截短型的TβRⅡ是一种更为安全、安稳和有用地医治纤维化的蛋白药物。
5 角质细胞成长因子基因工程药物
角质化细胞成长因子（keratinocyte growth factor，KGF）是成纤维细胞成长因子（FGF）宗族中的第七个成员，它介导多种安排中表（上）皮细胞增殖和分化来调控肺上细胞的损害[22]。Yao等[23]研讨标明，KGF经过调控音猥因子（SHH）信号通路来激活干细胞的分化，进而到达维护低氧诱导的肺纤维化。Sakamoto等[24]研讨标明，腺病毒过表达KGF可下降博来霉素诱导的纤维化的小鼠的致死率，阐明KGF能到达按捺纤维化发作。于程程等[25]研制出中性粒细胞按捺因子（neutrophil inhibitory factor，NIF）-KGF两层功用的基因嵌合体，随后的小鼠试验标明该嵌合体蛋白能显着按捺急性肺损害后循环内白细胞的添加和博来霉素诱导的肺炎及肺纤维化，提示其可用于医治肺纤维化和其它触及白细胞活化滋润及安排纤维化的多种临床疾病。
综上所述，工程药物具有活性高、毒性低、特异性强、生物功用清晰、有利于临床运用的特色。因为其本钱低、成功率高、安全可靠，故已成为医药产品中的重要组成部分。但蛋白质相对分子量大、对蛋白分化酶灵敏及在生物体内血浆铲除快、口服肯定生物使费用低，因而大多数医治性蛋白药物由静脉、肌内和皮下注射，其给药途径受限。一起，因为该类药物为外源性蛋白，其物理化学性质与小分子药物不同，药动学和药效学研讨面对许多困难，并且安稳性不高、在体内半衰期短、需频频给药、生物运用率低一级缺陷，在生理和心理上对患者形成极大的担负。未来应进一步完善工程药物的药动学和药效学研讨及药物的长效性的研讨，以取得抱负的医治效果。别的，关于其安全性及伦理性方面的问题也存在争议，这些问题能否妥善解决都将影响整个工业的开展前景。
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