朱江+何文姬+李翠莲++郭贵唐++杨光能++张桢
[摘要]意图 临床上树立一种快速、精确测定儿童血浆中维生素E含量的办法。办法 取儿童血浆200 μl，按v/v为8∶2的份额参加甲醇和异丙醇140 μl，涡旋30 s，参加正己烷1 ml，涡旋1 min，在室温条件下高速离心120 s（12 000×g），取离心后上清液700 μl，吹干，用100 μl甲醇复溶。色谱条件：选用Waters公司BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；取处理好的溶液5 μl进样，以0.3 ml/min的流速测定；甲醇-水（96∶4）为活动相；柱温为30℃；检测波长：291 nm。成果 血浆中维生素E色谱峰别离杰出，无搅扰线性回归方程为：y=118296x+11644，r2= 0.9997，回收率在90%～120%。定论 本办法操作简洁，适用于儿童血浆中维生素E含量的快速监测。
[关键词]维生素E；超高液相色谱法；儿童；血浆
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）1（c）-0015-03
UPLC method in the determination of the content of Vitamin E in plasma
1.Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University in Yunnan Province，Kunming 650032，China；2.Kunming Children′s Hospital in Yunnan Province，Kunming 650034，China
[Abstract]Objective To establish a rapid and accurate method in the determination of the content of Vitamin E in children′s plasma clinically.Methods 200 μl children′s plasma was collected.140 μl methanol and isopropanol were added with the proportion of v/v，8：2，which were vortexed for 30 s.1 ml n-hexane was added and vortexed for 1 min.They were centrifuged at a high speed at room temperature for 120 s （12 000×g）.700 μl supernatant was collected after centrifuge，blown dry and redissolved by 100 μl methanol.Chromatographic condition：BEH C18 chromatographic column from Waters company was applied （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）.The prepared solution of 5 μl was taken as a sample，and determined with the flow rate of 0.3 mL/min.Methanol-water （96：4） was the mobile phase.The column temperature was 30℃.Under the condition，the determination wavelength was 291 nm.Results The chromatographic peak of vitamin E in plasma was separated favorably，and non-interference linear regression equation was y=118296x+11644，r2 = 0.9997.The recovery rate was 90%-120%.Conclusion The method is simple to operate，which is suitable for the rapid determination of Vitamin E content in children′s plasma.
[Key words]Vitamin E；Ultra high liquid chromatography；Children；Plasma
維生素在儿童的正常成长发育中必不可少，合理均衡地摄入维生素是儿童体魄、智力正常开展的确保。维生素E发现于20世纪20年代，因为和人类的健康休戚相关，一向遭到广阔学者的重视，对其研讨也越来越多。维生素E又称生育酚（tocopherol）或抗不育维生素，为脂溶性维生素，金黄色或淡黄色黏稠油状物，易溶于脂肪、乙醇等有机溶剂，不溶于水，对热、酸安稳，对碱不安稳，对氧灵敏。维生素E能有用削减皱纹的发生、下降细胞耗氧量、抗动脉粥样硬化、按捺脂质过氧化及构成自由基、下降胆固醇、防备高血压、避免血液凝结、防备医治甲状腺疾病、改进血液循环、维护皮肤免受紫外线和污染的损害、加快创伤愈合等效果[1-4]。一起研讨提示维生素E具有抗氧化、免疫调节、操控炎症、基因表达和认知才能的调控等效果[5-6]。人体本身不能组成维生素E，对儿童血浆中维生素E的浓度进行测定不只能够对儿童营养状况进行调查研讨，也能够为临床上合理弥补维生素E供给相关根据。维生素 E 的测定办法有二阶导数光谱法、HPLC法、气相色谱法等，各种办法各有特色[7-15]。超高液相色谱（UPLC）是以超高速、超高灵敏度、超高别离度为特色的液相色谱。本研讨参照高效液相色谱法，改用UPLC法测定，旨在树立一种快速、精确测定儿童血浆中维生素E浓度的办法，现报导如下。endprint
1仪器及试剂
1.1仪器
Waters-ACQUITY-UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司），Sar-torius BT125D电子天平（德国赛多利斯仪器体系有限公司），Empower数据处理体系，MULTIFUGE X1R超高速离心机（美国Thermo公司），XW-80A涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）。
1.2试剂
对照品：维生素E（我国药品生物制品检定所，批号：100138-200603）；甲醇、乙腈：色谱纯（美国Fisher公司）；水：克己超纯水，水机（PURELAB ELGA公司，英国）。
2办法与成果
2.1色谱条件
选用Waters公司BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；取处理好的溶液5 μl进样（进样量），以0.3 ml/min的流速测定；甲醇-水（96∶4）为活动相；柱温为30℃；挑选291 nm为检测波长（维生素E）。
2.2样品
储藏液的制造：精细称定维生素E对照品5 mg，用甲醇稀释到50 ml量瓶中，充沛混匀既得维生素E的储藏液（1000 mg/L）。血样预处理：取儿童血浆200 μl，按v/v为8：2的份额参加甲醇和异丙醇140 μl，涡旋30 s，参加正己烷1 ml，涡旋1 min，在室温条件下高速离心120 s（12 000×g），取离心后上清液700 μl，吹干，用100 μl的甲醇溶液复溶。
2.3线性关系
取空白儿童血浆10份（每份200 μl），将不同浓度维生素E 50 μl参加空白血浆中，配成浓度为0.1、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 μg/ml溶液，按“2.2”操作，按拟定色谱条件以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，制作规范曲线，作线性回归，得规范曲线方程：y=118296x+11644，r2=0.9997，线性规模为1～60 μg/ml。
2.4空白试验
血浆依照“2.2”的处理办法和上述色谱条件进行试验，试验成果发现血浆中内源性杂质对维生素E不形成搅扰（图1、图2）。
2.5安稳性试验
2.5.1储藏液安稳性试验
取储藏液别离在1、3、5 d，制造规范运用液4 μg/ml，50 ug/ml直接进样测定，峰面积RSD为0.7%（4 μg/ml）、2.1%（50 μg/ml），标明储藏液至少在5 d安稳。
2.5.2血样安稳性试验
取同一供试品溶液，按上述色谱条件，选用高中低浓度的维生素E标本，在0、8、16、24 h进行测定，得到的峰面积RSD别离为2.4%（高浓度组）、2.1%（中浓度组）、1.1%（低浓度组）。成果提示血浆中的维生素E在24 h内安稳。
2.6重复性试验
取同一个批号的维生素E对照品精细称定5 mg，按样品测验条件进行测定，求得维生素 E含量的RSD值为1.2%
2.7回收率试验
在标本中参加0.5～2倍的维生素E规范品后，按血样预处理的办法进行处理，依照“2.1”的色谱条件测定，核算回收率，回收率在97.2%～110.0%，RSD值为0.63%（表1）。
2.8样品测定成果
本试验选用UPLC法测定300例健康儿童血浆中维生素E的含量，测得浓度规模为16.31～32.23 μmol/L，平均值为（24.27±7.69） μmol/l。
3评论
维生素E易溶于正己烷而与水溶性成别离离，可到达提纯的效果，本研讨中运用少数异丙醇溶解、定容，增大了测定浓度。挑选吸收波长291 nm作为测定波长，灵敏度高，响应值强，主峰周围无其他杂峰搅扰，专特点强。本研讨树立了UPLC测定儿童血浆中维生素E浓度的办法，成果提示本办法别离效果好、办法简洁、方便、精确、专特点好，可用于儿童血浆中维生素E含量的测定，可为临床弥补维生素E供给根据。维生素 E 有着广泛的药物功用，尤其是其优秀的抗氧化性，在新生儿疾病的防备和医治方面具有积极效果和重要意义，也是新生儿正常成长发育所必需的物质[16]。王晓燕等[16]总结了维生素E在儿科中的运用发现维生素E作为体内重要的抗氧化剂在医治新生儿缺血性脑病、贫血、新生儿硬肿、新生儿高胆红素血症和新生儿尿布皮炎等疾病中都有必定的效果。口服维生素E后通过被迫分散进人到小肠上皮细胞， 在人体内吸收率存在差异，不同个别中的吸收率为20%～60% 不等；在这个过程中胰腺功用、胆汁酸盐活性、脂肪的摄入量等要素都会影响其吸收率。
维生素E在体内不能组成，有必要从食物中取得，现在普遍以为成人维生素E的日需要量为15～20 mg，过量运用维生素E会导致机体免疫才能下降，一起还会影响其他维生素的吸收。近年来对维生素E的日弥补剂量和毒副效果的研讨引起了广阔学者的重视，梁世秀[17]研讨了海参对维生素E的需要量以及维生素E对海参非特异免疫的影响，别离用不同剂量的维生素E喂食海参60 d，成果显现100 mg/（kg·d）维生素E喂食组成长速率最快，体内超氧化物歧化酶活性最高，因而适量弥补维生素E有利于添加机体的免疫力。关于儿童维生素E的日弥补剂量参照成人规范，可是因为儿童特别的身体结构和生理功用，笔者以为维生素E的成人弥补剂量不能彻底反响儿童维生素E的弥补剂量，因而，应该对不同年龄阶段体内维生素E的正常含量做出点评。不同年龄阶段或许不同个别维生素E的日弥补剂量也是往后的研讨方向，特别是对早产儿和新生儿维生素 E 的医治剂量的研讨也亟待解决。
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（收稿日期：2017-10-30 本文修改：闫 佩）endprint
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