杨静??尹娜娜??苗爱东
[摘要] 意图 树立呋柳擦剂的微生物极限查看办法。 办法 制备供试液时参加了聚山梨酯80，并与未加聚山梨酯80供试液的验证成果相比较。 成果 未加聚山梨酯80的供试液存在抑菌活性，而参加15g聚山梨酯80的供试液，选用培育基稀释法各实验菌的回收率均>70%。 定论 呋柳擦剂可选用参加聚山梨酯80的供试液制备办法进行微生物极限查看。
[关键词] 呋柳擦剂；聚山梨酯80；微生物极限查看；办法验证
[中图分类号] R927.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）17-48-03
Research on test methods of microorganism limit of Fu Liu liniment
YANG Jing YIN Nana MIAO Aidong
Beijing Military Region Joint Logistics Department Drug and Instrument Test Institute，Beijing 100071，China
[Abstract] Objective Establish microorganism limit test of Fu Liu Liniment. Methods Add Polysorbate 80 when preparing test solution，and compare the test result with the test solution without Polysorbate 80. Results Antibacterial activities appeared in the test solution without Polysorbate 80，but for the one with 15g Polysorbate 80，the recovery rate of every tested microorganisms is larger than 70%. Conclution We can conduct microorganism limit test of Fu Liu Liniment by adding Polysorbate 80.
[Key words] Fu Liu liniment；Polysorbate 80；Microorganism limit test；Method validation
呋柳擦剂为皮肤病外用制剂，由水杨酸、苯甲酸、鞣酸和呋喃西林等成分组成，本品具有按捺真菌、止痒等效果，首要用于手足癣和体癣等各种皮肤癣症的医治。按惯例办法制备供试液时，制剂中的首要化学成分存在显着的抑菌活性，难以保证实验成果的牢靠性[1-5]。供试品参加15g聚山梨酯80混匀后再参加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制备的供试液为弄清的液体，选用培育基稀释法各实验菌的回收率均大于70%。现将成果报导如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器
HTY-2000 集菌仪（杭州泰林医疗器械厂）；GH-6000隔水式培育箱（天津泰斯特仪器有限公司）；LRH-250-MS霉菌培育箱（韶关泰宏医疗器械有限公司）；DF3-3红外线高温干燥箱（北京兴争仪器设备厂）；LDZX立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。
1.2 菌种
验证用实验菌种均购于我国药品生物制品检定所，包含：大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。
1.3 培育基
玫瑰红钠琼脂培育基、养分琼脂培育基、养分肉汤培育基、改进马丁琼脂培育基、改进马丁培育基、胆盐乳糖培育基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号别离为1312192、131218、131016、120113、1309122、140110、140124）均购于我国药品生物制品检定所；聚山梨酯80（上海申宇医药化工有限公司）；呋柳擦剂（批号：20120917、20130312、20130313）。
2 实验办法与成果
依照《我国药典》2010年版，第一部[4]附录XⅢ C微生物极限查看法进行验证实验。
2.1 菌液制备
2.1.1 将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌，别离接种至10mL养分肉汤培育基中，35℃培育24h，别离取上述培育物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，制成每1mL含菌数约为50～100cfu的菌液，备用。用于操控菌查看时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，制成每1mL含菌数约为10～100cfu的菌液，备用。
2.1.2 将白色念珠菌接种至10mL改进马丁培育基中，25℃培育24h，取上述培育物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，制成每1mL含菌数约为50～100cfu的菌液，备用。
表1 惯例法的回收率实验成果（%）
组别 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽胞杆菌 白色念珠菌 黑曲霉
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
A组 61 60 64 23 24 26 0 0 0 92 91 90 87 90 85
B组 98 90 93 100 103 99 28 29 26 92 93 95 90 93 92
C组 98 100 102 100 100 96 98 96 100 100 99 100 95 100 100
表2 培育基稀释法的回收率实验成果（%）
组别 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽胞菌 白色念珠菌
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
A组 96 90 94 23 25 26 0 0 0
57 55 60 0 0 0
B组 88 80 86
2.1.3 将黑曲霉的新鲜培育物接种至改进马丁琼脂斜面培育基中，25℃培育5～7d，有很多的孢子发生，参加5mL 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，制成含菌数约为50～100cfu/mL的孢子悬液，备用。
2.2 供试液的制备
A组：取呋柳擦剂10mL，参加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，摇匀，制成1∶10的供试液；B组：取呋柳擦剂10mL，参加15g聚山梨酯80混匀后再参加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，摇匀，制成1∶10的供试液；C组：取15g聚山梨酯80参加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，摇匀，作为稀释剂对照组。
2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数办法验证
2.3.1 实验组 （1）惯例法：取1mL供试液和50～100cfu实验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL养分琼脂培育基，摇匀、培育、调查成果。（2）培育基稀释法：别离取0.5和0.2mL的供试液和50～100cfu实验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL 养分琼脂培育基，摇匀、培育、调查成果。各实验菌株的回收率成果，见表l。
2.3.2 菌液组 取50～100cfu实验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL养分琼脂培育基，摇匀、培育、调查成果。
2.3.3 供试品对照组 （1）惯例法：取1mL供试液，注入平皿中，每皿加15～20mL养分琼脂培育基，摇匀、培育、调查成果。（2）培育基稀释法：别离取0.5和0.2mL的供试液，注入平皿中，每皿加15～20mL 养分琼脂培育基，摇匀、培育、调查成果。
2.3.4 稀释剂对照组 （1）惯例法：取1Ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和50～100cfu实验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL养分琼脂培育基，摇匀、培育、调查成果。（2）培育基稀释法：别离取0.5和0.2mL的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和50～100cfu实验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL l养分琼脂培育基，摇匀、培育、调查成果。
2.3.5 实验组回收率（%）=[（实验组均匀菌落数-供试品对照组均匀菌落数）/菌液组均匀菌落数]×100%。
从表1的回收率实验成果能够看出：选用惯例法，A组对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的回收率均<70%，对枯草芽胞杆菌的回收率为0，阐明制剂中的成分有明显的抑菌效果。B组仅对枯草芽胞杆菌的回收率<70%，因而，先挑选培育基稀释法测定各抑菌菌株的回收率，见表2。
从表2的回收率实验成果能够看出：A组选用0.2mL皿供试液的培育基稀释法后，对金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌的回收率仍低于70%。B组选用0.5mL/皿供试液的培育基稀释法后，对枯草芽胞杆菌的回收率即到达了70%，阐明参加的15g聚山梨酯80 起到了中和抑菌性的效果。
2.4 操控菌查看办法的验证
呋柳擦剂为外用溶液剂，依照《我国药典》2010年版，第二部[6]规则，操控菌应查看金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。
2.4.1 金黄色葡萄球菌 实验组：（1）惯例法：取1∶10的供试液10mL和含菌数约为10～100cfu的金黄色葡萄球菌，参加到100mL养分肉汤培育基中。（2）培育基稀释法：取1∶10的供试液10mL和金黄色葡萄球菌10～100cfu，参加到200 mL养分肉汤培育基中。
供试品组：除不加金黄色葡萄球菌外，其他操作同实验组。
阳性对照组：除不加供试液外，其他操作同实验组。
阴性对照组：用稀释液替代供试液，其他操作同实验组。
2.4.2 铜绿假单胞菌 实验组：（1）惯例法：取1∶10的供试液10mL和含菌数约为10～100cfu的铜绿假单胞菌，参加到100mL胆盐乳糖培育基中。（2）培育基稀释法：取1∶10的供试液10mL和铜绿假单胞菌10～100cfu，参加到200mL胆盐乳糖培育基中。
供试品组：除不加铜绿假单胞菌外，其他操作同实验组。
阳性对照组：除不加供试液外，其他操作同实验组。
阴性对照组：用稀释液替代供试液，其他操作同实验组。操控菌查看办法的验证成果，见表3。
表3 操控菌查看办法的验证成果
药品称号 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌
惯例法 稀释法 惯例法 稀释法
A组 - - - +
B组 - + + /
注：表中“+”代表该反响呈阳性，“-”代表该反响呈阴性。
2.5 微生物极限查看办法的验证成果
2.5.1 计数办法的验证成果 经过验证实验，选用0.5mL/皿供试液的培育基稀释法即能有用去除其抑菌效果，使回收率均到达70%以上。
2.5.2 操控菌查看办法的验证成果 呋柳擦剂选用培育基稀释法查看金黄色葡萄球菌，选用惯例法查看铜绿假单胞菌。
3 评论
呋柳擦剂含水杨酸、苯甲酸、鞣酸和呋喃西林等成分，在10mL供试品中直接参加稀释剂制成的供试液，对实验菌有较强的抑菌性。当制备供试液时先将10mL供试品与15g聚山梨酯80混合后，再参加稀释剂制成的供试液，能有用去除其抑菌效果，办法简略、快速，节省本钱，科学牢靠。聚山梨酯80是非离子型表面活性剂，具有乳化、增溶和安稳的效果，一方面增加了药品的溶解性，另一方面临微生物有维护效果[7-11]，经过实验证明，聚山梨酯80对实验菌株无抑菌性，不会对微生物形成损害[12-16]。在供试品中增加聚山梨酯80可有用地下降其抑菌性，但由于不同的供试品抑菌性不同，抑菌性强需求其浓度高，可在实验中恰当调理。实验中发现，在制备供试液时应充沛摇匀，使供试品在稀释剂中涣散均匀，保证实验的重复性和牢靠性。
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（收稿日期：2015-07-10）
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