刘柯伶?贾蓓
[摘要] 意图 运用两种荧光原位杂交（FISH）试剂盒检测羊水染色体，比较两者在临床的运用作用。 办法 选用北京金菩嘉和美国雅培Vysis出产的FISH试剂盒对30例未培育的羊水进行染色体检测，比较两者在信号强度和杂交率的差异。 成果 30例样本均获得FISH检测成果，且两种试剂临床确诊契合率到达100%，杂交率无计算学含义（P>0.05）。Vysis试剂21/13染色体荧光杂交信号较强，金菩嘉试剂18染色体信号清楚，不易交融。 定论 Vysis与金菩嘉两种FISH检测试剂运用染色体反常产前确诊均可到达相同的临床确诊作用。
[关键词] 荧光原位杂交；产前确诊；染色体非整倍体
[中图分类号] R714.53 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）10-242-04
Comparative study on application of two fluorescence in situ hybridization （FISH） kits for inspecting amniotic fluid chromosomes
LIU Keling1 JIA Bei2
1.Department of Obstetrics Baoan District People's Hospital，Shenzhen 518101，China；2.Department of Obstetrics，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510512，China
[Abstract] Objective Two fluorescence in situ hybridization （FISH） kits were utilized to inspectamniotic fluid chromosomes，to compare the both kits in clinical application. Methods Two fluorescence in situ hybridization （FISH） kits from Beijing GPmedical and Abbott were utilized to inspect 30 samples of amniotic fluid chromosomes.Their differences in respect of signal intensityand hybridizing were compared. Results All samples of the 30 cases were successfully detected by the both FISH kits.The hybridizing ratethere was no significant difference （P>0.05）.Vysis kits 21/13 chromosome fluorescent hybridization signal was stronger than the GP kits.The GP kits 18 chromosomes signal was clear and not easy to fuse. Conclusion the FISH kits from the Beijing GPmedical and Abbott Vysis can make the same prenatal diagnosis for the chromosome abnormality.
[Key words] Fluorescence in situ hybridization；Prenatal dignosis；Chromosomal aneuploid
熒光原位原位杂交技能（FISH）依据分子细胞遗传学开展的学科，始于1998年，至今在临床研讨中广泛运用，在产前确诊范畴更是不断完善和推行[1-3]。因为商业试剂盒运用便利、高效、安稳且专业化，临床上更喜爱选用FISH商业试剂盒进行产前确诊[4]，如美国雅培Vysis公司（美国），其试剂以极高的灵敏度及可重复性在临床运用中极受欢迎。目前我国金菩嘉公司（我国）自行研制成功FISH商业试剂盒可满意产前确诊系列运用。本课题经过雅培Vysis公司和金菩嘉公司别离研制的FISH试剂盒进行临床运用比较，以便国产FISH商业试剂盒的优化，增强市场竞赛力。
1 材料与办法
1.1 一般材料
随机选取2009年3～10月在南边医院行产前确诊的高危孕妈妈30例，年纪18～44岁，均匀（30.4±5.3）岁。孕周17～37周，均匀（23.1±4.4）周。产前确诊指征包含：（1）孕妈妈年纪≥35岁10例；（2）母血清唐氏筛查高风险15例；（3）超声筛查反常，指羊水过多、心室强光点、腹部双泡征、双侧脉络丛多回声区等共3例；（4）多项指征，契合前面恣意两项或两项以上者1例；（5）IVF-ET术后且极度焦虑孕妈妈1例。一切孕妈妈均签署产前确诊知情同意书。挑选这30例的液氮冻存的未培育的羊水标本，结合其核型剖析进行两种FISH确诊试剂（金菩嘉及雅培Vysis）的检测。
1.2 首要试剂及仪器
1.2.1 试剂盒 选用美国 VysisFISH检测试剂盒及北京金普嘉公司FISH试剂盒。
1.2.2 仪器 选用OLYMPUS公司（BX-51）的荧光显微镜、OLYMPUS公司的显微照相机、Thermobrite原位杂交仪及VideoTest公司的FISH2.0剖析软件。
1.3 办法
1.3.1 惯例染色体核型剖析 30例产前确诊孕妈妈在超声指导下无菌抽取羊水20mL，其间15mL行惯例羊水细胞培育，一起对其新生儿或引产的死胎进行脐血或外周血的细胞培育以核实反常的染色体核型。将这些培育的细胞均进行G显带，染色体核型剖析，剖析3个割裂相，嵌合体计数100个割裂相。染色体核型剖析依据人类细胞遗传学国际命名体系（ISCN1995）命名。
1.3.2 FISH检测 （1）FISH标本预处理，5mL羊水在1500rpm离心去上清，加5mL KCL低渗液，37℃水浴后固定3次后去上清至1mL滴片室温过夜老化。将老化玻片参加37℃胃蛋白酶溶液消化放入2×SSC溶液漂洗2次，取出玻片顺次置于70%、85%、100%乙醇梯度脱水后室温天然枯燥。依照商业试剂盒程序装备各自探针备用。
1.3.2.2 DNA变性、杂交及洗刷 （1）Vysis公司FISH试剂盒：参照试剂盒阐明书进行，在过程上作依据试验室条件进行改善：将探针滴于杂交区域，放入杂交仪73℃变性1min，37℃杂交16h。杂交后放入（73±1）℃的0.4×SSC/0.3% NP-40液洗刷2min转至室温2×SSC/0.1% NP-40液，再洗刷15～30s，放入70%乙醇3min取出暗處天然枯燥。（2）金菩嘉公司FISH试剂盒甲酰胺变性程序：参照试剂盒阐明书进行，在过程上作依据试验室条件进行改善：将玻片放入（73±1）℃的70%的甲酰胺/2×SSC液变性5min，将玻片顺次置于-20℃的70%、80%、100乙醇进行梯度脱水。玻片天然枯燥在45～50℃烤片机与变性好的探针杂交，42℃下杂交16h。杂交玻片顺次放入46±1℃的50%甲酰胺/2×SSC，2×SSC，2×SSC/0.1NP-40洗刷各10min，转至2×SSC液洗刷5～10min。再转至2×SSC/0.1%NP-40液洗刷5min。70%乙醇固定取出暗处天然枯燥。（3）复染与镜检：每个杂交区域加DAPI复染剂封片后室温暗处放15～20min。每张片随机剖析计数50～100个间期核，并记载杂交信号。（4）在荧光显微镜下调查间期核FISH检测信号，惯例随机对每组探针计数100个细胞，扫除彼此堆叠及弥散杂交信号、杂交不均匀区域。
1.4 计算学办法
成果数据运用SPSS13.0计算，对30例杂交率进行定量配对t查验。P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 30例样本间期核的两种FISH试剂检测与核型剖析契合率
金菩嘉及雅培Vysis两种FISH试剂检测的产前确诊契合率为100%，见表1。
2.2 临床随访确诊状况
3例21-三体胎儿和1例18-三体胎儿引产后，脐血染色体核型证明均与羊水核型剖析成果共同。26例羊水染色体正常者均追寻查看其新生儿，与新生儿外周血染色体核型剖析共同。
2.3 30例样本间期核FISH检测杂交率比较
两种FISH试剂杂交率的比较有明显差异（21/13试剂盒P<0.01；8xy试剂盒，P<0.01）。Vysis公司出产的探针杂交率高于金菩嘉公司，见表2。
2.4 金菩嘉及Vysis两种FISH试剂检测信号图
荧光显微镜调查下Vysis18信号反常亮堂且弥散，金菩嘉18信号相同亮堂但简单判读（图1）。
3 评论
FISH技能是一种非放射性原位杂交技能，原理是在已知单链核酸上符号荧光后作为探针，依照碱基互补准则，与检测标本的方针单链核酸特异性结合，在荧光显微镜下调查杂交后的荧光信号，判别结合的染色体区域反常与否[5-6]。FISH的产前确诊运用探针，能够针对性的检测细微的单一序列（位点特异性序列LSI）、着丝粒特异性序列（CEP）和整条染色体。LSI探针可辨认方针DNA的特异序列，CEP依据辨认染色体着丝粒及接近着丝粒区域的重复DNA序列来检测染色体数目。市场上出售的商业探针与装备好的阻滞剂结合融于杂交液里，遵从运用阐明书上的规则的浓度和杂交参数才干得到最好的临床运用作用。自用及商用FISH试剂盒依据在临床运用的反响和各个范畴的探究推行，各个试验室均会对探针的类型、制备工艺和运用计划进行不断优化和完善[7]。本研讨中的两种探针在检测羊水染色体的操作程序上，最大的区别是杂交仪的运用状况。Vysis探针装备自己研制的FISH专用杂交仪和其主动预处理体系，极大的节省人工和试剂本钱，削减有害溶液的用量，严格控制反响温度和环境湿度，进一步进步试验功率和改善试验环境。相比之下，金菩嘉探针要想获得最佳的检测作用，仍需人工甲酰胺变性、杂交及杂交后的洗刷这一系列传统过程，这将是国产探针急需改善的技能环节。
本研讨标明两种试剂盒的与核型剖析的确诊契合率为100%（见表1），与文献报导的相似[8-9]，具有灵敏度高及特异性强[10]，到达产前确诊运用要求。但两种FISH试剂杂交率存在差异（见表2）。Vysis公司探针杂交率优于金菩嘉，特别是21/13探针。Vysis 18信号亮堂但弥散（图1），阅片计数时一部分难以判别信号个数（一个或许两个），对反常标本信号调查可发作假阳性或许；而金菩嘉18探针信号调查明晰、简单判别（图1）。18xy探针的规划碱基配对部位定在DNA的着丝粒部位[11-12]，发生的信号较为会集而亮堂，便利辨认和计数。而18探针信号呈现弥散的原因，是因为当一些羊水细胞核进入细胞周期S期时会呈现相似G2期的配对信号，即一条染色体割裂成两条染色体单体时，接近细微信号就会呈现接连信号，这时阅片时计数为一个信号[13]。因探针荧光上色是依据DNA单链的螺旋排序呈纵向，所以有时着丝粒探针或较长的基因组探针发生的信号可呈接连性，这时也以一个信号计数。因而探针选取的适合方针DNA碱基对和细胞核所处于的细胞周期是获取别离且亮堂的FISH信号的重要因素[7]。
阅片中发现21、13号染色体探针信号远不如18号染色体探针信号亮堂，这是因为21/13探针是针对特异性重复序列规划（串联重复alpha-卫星序列探针）的，存在个别的差异性，促进FISH探针显现的信号不安稳，乃至遇到杂交序列太短构成的信号较弱，即便在荧光显微镜下却无法调查，就会呈现假阴性，导致21号染色体非整倍的漏诊[14-16]。
21/13及18XY探针与荧光素符号的技能含量不同，导致检测信号强度及分辨率不同，这也是商业试剂盒的竞赛中心地点。本研讨提示国产探针临床运用与国际一流的商业探针虽存在必定距离，但仍不乏亮点，咱们需求总结经验完善探针质量，在不断改善中提高本身竞赛力。
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（收稿日期：2017-02-29）
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