刘德贤扥
x[摘要] 意图 树立咳喘颗粒的HPLC指纹图谱办法，为科学地点评咳喘颗粒的质量供给根据。 办法 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）以乙腈-0.1%磷酸水为活动相梯度洗脱，检测波长237 nm，流速1.0 ml/min，柱温：30℃。 成果 断定了16个共有峰，10批咳喘颗粒指纹图谱的类似度均>0.96。 定论 树立了别离效果好、简略、活络、精确的办法，可用于咳喘颗粒质量点评的办法。
[关键词] 咳喘颗粒；高效液相色谱；指纹图谱；类似度
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）02（a）-0008-04
Study on HPLC fingerprint of Kechuan granules
LIU De-xian1，2 TAO Zun-wei2 ZHANG Ting2 ZHANG Yan2
1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300073，China；2.Tianjin Institute of Medical Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China
[Abstract] Objective To establish HPLC fingerprint of Kechuan granules for the quality control of its scientifically.Methods Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm）；acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution was used as the mobile phase for the gradient elution；the wavelength was set at 237 nm；the mobile phase at 30℃；the velocity of 1.0 ml/min to record the HPLC chromatograms of ten batches of samples. Results Sixteen common peaks were confirmed and similarity of 10 batches of Kechuan granules was more than 0.96. Conclusion The established method is sensitive，accurate and simple，and it can be used specifically for the quality control of Kechuan granules.
[Key words] Kechuan granules；HPLC；Fingerprint；Similarity
咳喘颗粒为院内制剂，由五味子、白芍、甘草、黄芩等14味中药组成，具有解表散寒、温肺化饮之成效，医治咳嗽、哮喘效果显著，未见相关的指纹图谱报导。中药复方效果特色相得益彰，即多成分、多体系、多靶点的归纳效应[1-3]，因而用单一目标成分往往不能到达全面点评和操控复方制剂质量的效果，而指纹图谱因为其具有多目标全面剖析的效果[4-5]，已成为点评中药质量的有用办法，并被广泛用于中药及其复方制剂的质量操控研讨[6-10]。因而，为了更好地操控咳喘颗粒质量，为临床用药供给根据，本试验选用HPLC办法[11-12]树立咳喘颗粒的化学指纹图谱，侧重表达药材的信息。对咳喘颗粒指纹图谱中首要指纹峰进行归属，完成体系、多角度操控咳喘颗粒质量。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪（LC-20AT日本岛津公司），PDA检测器；超声仪（KQ-250B，昆山市超声仪器有限公司）；电子剖析天平（ABS135-S，瑞士梅特勒-托利多公司）；电子天平（JJ200，常熟双杰测验仪器厂 ）。
1.2 试药
芍药苷对照品（批号：1110736-200934，由我国食品药品检定研讨院供给）、甘草苷对照品（批号：11610-201106）、黄芩苷对照品（批号110715-201117）、甘草酸铵对照品（110731-200615）、五味子醇甲对照品（110857-201211），以上五种对照品均由我国药品生物制品检定所供给）；乙腈（色谱纯，迪马科技有限公司），甲醇（色谱纯，迪马科技有限公司），甲醇（剖析纯，天津市化学试剂批发公司），乙醇（剖析纯，天津市化学试剂批发公司），娃哈哈纯净水（天津娃哈哈宏振饮料有限公司），咳喘颗粒（批号：tl20140507001～tl20140507010，医内制剂）。
2 办法与成果
2.1 色谱条件
色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；活动相A为乙腈，活动相B为0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0～20 min，10%～15%A；20～30 min，15%～30%A；30～50 min，30%～50%A；50～90 min，50%～90%A；90～100 min，90%～100%A；检测波长237 nm，流速1.0 ml/min，剖析时刻75 min，进样量10 μl。
2.2 对照品溶液的制备
精细称取芍药苷、甘草苷、黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲对照品适量，加甲醇溶解并定容，制成质量浓度别离为0.05、0.1、0.04、0.085、0.18 mg/ml的混合对照品溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备
取咳喘颗粒约5.0 g，置50 ml具塞锥形瓶中，精细参加50%甲醇50 ml，称定分量，回流提取60 min，放冷，用50%甲醇补足减失的分量，摇匀，滤过，续滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。
2.4 体系适用性试验
别离取供试品（tl20140507001）和对照品溶液进样，记载237 nm波长下色谱图。对保存时刻和紫外光谱图进行比照可知6、7、10、15、16号峰别离是芍药苷、甘草苷、黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲。10号峰（黄芩苷）10批供试品均有，峰型好，峰位适中，与相邻峰别离杰出。因而作为参照物峰，如图1、图2。在此条件下，理论塔板数以黄芩苷核算>2500。
图1 批号（tl20140507001）样品HPLC色谱图
图2 对照品HPLC色谱图
6.芍药苷；7.甘草苷；10.黄芩苷；15.甘草酸铵；16.五味子醇甲
2.5 办法学调查
2.5.1 精细度试验 精细取样品（tl20140507001）溶液，接连进样6次，按“2.1”项色谱条件测定，调查各色谱峰相对保存时刻及相对峰面积的一致性。成果，各色谱峰相对保存时刻的RSD为0.03%～0.51%，相对峰面积的RSD为1.24%～2.76%，标明仪器精细度杰出。
2.5.2 安稳性试验 精细取样品（tl20140507001）溶液，别离于0、4、8、16、24、48 h，按“2.1”项下色谱条件测定，以10号峰（黄芩苷）为参照峰，调查各色谱峰相对保存时刻及相对峰面积的一致性。成果，各色谱峰相对保存时刻的RSD为0.04%～0.46%，相对峰面积的RSD为0.78%～2.12%，标明供试品溶液在48 h内安稳。
2.5.3 重复性试验 取样品（tl20140507001）溶液，精细称取5份，依照“2.3”下办法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以10号峰（黄芩苷）为参照峰，调查各色谱峰相对保存时刻及相对峰面积的一致性。成果，各色谱峰相对保存时刻的RSD为0.03%～0.37%，相对峰面积的RSD为1.05%～2.47%，标明供试品溶液在48 h内安稳。
2.6 标定共有峰
对10批咳喘颗粒进行检测，记载色谱图，以共有率100%记，共有16个共有峰，10批咳喘颗粒HPLC图谱各共有峰相对保存时刻除11号（1.5189）、13号（1.7136）、14号（2.6392），其他均<1.0，契合指纹图谱要求，成果见表1、表2。
2.7 树立指纹图谱共有形式
将10批咳喘颗粒HPLC色谱图导入“中药色谱指纹图谱类似度点评体系”（2004A版），以S5为参照，选用中位数法生成对照图谱和共有形式图谱，如图3。
2.8 指纹图谱类似度点评
选用“中药色谱指纹图谱类似度点评体系”（2004A版）对上述10批咳喘颗粒样品进行特征图谱类似度核算，成果见表3。成果显现，10批咳喘颗粒类似度点评成果均>0.96，直观阐明各批次咳喘颗粒之间无显着差异性，本办法可用于辨别咳喘颗粒的全体质量。
3 评论
3.1 指纹图谱检测波长的断定
调查了咳喘颗粒首要成分，参照相关文献[13-21]，别离对210、237、250、294 nm进行挑选。210、290 nm出峰较少，且出峰时刻较晚。250 nm出峰较多，可是基线漂移。237 nm时出峰多、别离度好、基线平，因而选237 nm为检测波长。
3.2 活动相的挑选
本试验首要对等度洗脱与梯度洗脱进行挑选，成果等度洗脱别离度不如梯度洗脱好，因而挑选梯度洗脱。其次，对甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水四种活动相进行挑选，成果甲醇-磷酸、乙腈-磷酸峰型较甲醇-水、乙腈-水好，且基线平，乙腈-磷酸较甲醇-磷酸出峰多。因而，活动相挑选乙腈-磷酸梯度洗脱。
3.3 提取条件的挑选
本试验首要对不同提取办法（超声提取办法和加热回流提取办法）进行挑选，成果回流提取较超声提取出峰多且峰型好，因而挑选回流提取。其次对提取溶剂进行挑选，样品别离加50 ml 25%甲醇、25%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、75%甲醇、75%乙醇、纯甲醇、纯乙醇溶液加热回流提取，成果50%甲醇提取出峰最彻底，别离度最好，所以挑选50%甲醇提取。终究调查提取时刻，别离用50%甲醇回流提取15、30、45、60 min，成果超声30 min，样品出峰最彻底，所以挑选30 min。因而，终究提取条件为50%甲醇回流提取30 min。
3.4 参照峰的断定
经过比较对照发现，6号峰是芍药苷对照品峰，为咳喘颗粒白芍的主成分峰，峰面积大，但因为有拖尾现象；7号基线不平且别离度欠好；15、16号峰峰型较小；因而6、7、15、16均不宜作参照峰；而10号峰峰面积较大，出峰时刻较安稳，基线较平，因而选作参照峰。
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（收稿日期：2014-11-03 本文修改：郭静娟）
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