杨烽
[摘要]意图 研讨端粒酶逆转录酶（TERT）基因润饰的骨髓间充质干细胞（BMSCs）促进脑伤口（TBI）大鼠脑安排自噬及认知功用的效果，评论可能的分子机制。办法 别离并判定大鼠BMSCs，使用pLXSN-TERT病毒重组子转染BMSCs。使用Marmarou办法制备脑伤口TBI大鼠模型。将64只大鼠随机分为四组，别离为TBI组、BMSCs-TBI组和TERT-BMSCs-TBI组和对照组，每组各16只。使用HE染色光镜调查大鼠脑安排结构及病理改动。Western blot检测BDNF、NGF等神经成长因子的蛋白表达水平；检测自噬相关因子Beclin1和Parkin的蛋白表达水平。使用Morris水迷宫办法检测大鼠学习回忆认知功用的改动。成果 在Morris水迷宫检测大鼠定位飞行实验中，与对照组比较，TBI组均匀躲避潜伏期延伸（P<0.05）；与TBI组比较，TERT-BMSCs-TBI组、BMSCs-TBI组均匀躲避潜伏期缩短（P<0.05）。在空间探究实验中，TBI组大鼠在原渠道象限的停留时刻显着较对照组大鼠缩短；而TERT-BMSCs-TBI组、BMSCs-TBI组与TBI组比较，在原渠道象限的停留时刻显着延伸（P<0.05）。Western blot检测发现，与TBI组比较，BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组脑皮层安排中BDNF、NGF、Beclin1、Parkin蛋白表达水均匀升高（P<0.05）；与BMSCs-TBI组比较，TERT-BMSCs-TBI组显着升高（P<0.05）。定论 TERT修飾的BMSCs较一般BMSCs移植TBI大鼠学习回忆认知功用恢复更显着，其分子机制可能与增强自噬功用有关。
[关键词]脑伤口；端粒酶；骨髓间充质干细胞；自噬；认知功用
[中图分类号] R651.15 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）07（c）-0104-04
Effects and mechanisms of TERT modified bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on autophagy and cognitive function in TBI rats
YANG Feng
Department of Neurosurgery，the Sixth People′s Hospital of Chongqing，Chongqing 400060，China
[Abstract]Objective To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） under modification of telomerase reverse transcriptase （TERT） gene in improving brain tissue autophagy and cognitive function of rats with traumatic brain injury （TBI），as well as to investigate possible molecular mechanisms.Methods BMCSs of rats was separated and authenticated，pLXSN-TERT virus recombinants were applied to carry out transfection of BMSCs，Marmarou method was adopted to prepare the models of rats with TBI. 64 rats were randomly divided into four groups，namely TBI group，BMSCs-TBI group，TERT-BMSCs-TBI group and the control group，with 16 rats in each group.HE light microscopy was used to observe the brain tissue structure of rats and pathologic change.The protein expression levels of BDNF，NGF and other nerve growth factors were detected with Western blot；as well as the protein expression levels of Beclin1 and Parkin relevant to autophagy were detected correspondingly.Then Morris （Morris Water Maze） was applied to detect the change on learning and memorizing cognitive function of rats.Results Among Morris detecting place navigation test of rats，the mean escape latency of TBI group prolongs compared to the control group （P<0.05）.Compared to TBI group，the TERT-BMSCs-TBI group and BMSCs-TBI group take less mean escape latency （P<0.05）.In the space probe trial，the duration of stay of TBI group in original platform quadrant was obviously less than the control group；the duration of stay of TERT-BMSCs-TBI group and BMSCs-TBI group significantly prolong compared to TBI group （P<0.05）.Through Western blot detection，the result indicated that expression of protein of BDNF，NGF，Beclin1，Parkin in brain mantle tissue increased obviously in TERT-BMSCs-TBI group and BMSCs-TBI group compared to TBI group （P<0.05），and significantly increased in group TERT-BMSCs-TBI compared with BMSCs-TBI group （P<0.05）.Conclusion Compared to general BMSCs transplant，the rats with BMSCs under modification of TERT have more significant learning and memorizing cognitive recovery function，that the molecular mechanism may be related to autophagy function enhancement.
[Key words]Traumatic brain injury；Telomerase；Bone marrow mesenchymal stem cells；Autophagy；Cognitive function
腦伤口（traumatic brain injury，TBI）是神经外科较为常见的一种多发病，逝世率和伤残率居严峻伤口之首[1]。下降TBI的逝世率、致残率以及进步患者的预后一直是神经外科范畴研讨的要点和难点[2]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是干细胞的一种，可诱导内源性干细胞增殖，促进脑安排再生以及神经功用恢复[3-4]。细胞自噬是细胞内极为有用的铲除机制，中枢及外周安排内细胞自噬能够添加细胞代谢水平，有助于代谢废物的铲除，保持细胞内蛋白质质量的相对安稳[5-6]。本研讨使用Marmarou办法制备TBI大鼠模型，使用端粒酶逆转录酶TERT基因润饰的骨髓间充质干细胞移植到脑伤口大鼠后，调查BDNF、NGF、自噬相关因子Beclin1和Parkin的蛋白表达水平，使用Morris水迷宫办法检测TBI大鼠学习回忆认知功用，评论端粒酶添加的BMSCs对TBI大鼠的恢复医治效果与自噬功用的相关性。
1材料与办法
1.1实验目标与仪器
1.1.1 BMSCs 孵育条件：无菌；混合细胞取得办法：L-DMEM培育基（北京天根生化有限公司）（含10% FBS）重复冲刷大鼠股骨、胫骨骨髓腔取得混合细胞。换液频率：每3天换1次。传代比率为1∶2。传代条件：细胞融合率为85%。
1.1.2 TERT润饰BMSCs及细胞克隆实验 构建反转录病毒载体重组子pLXSN-TERT[7]。使用转染试剂Lipofectamine 2000（北京沃比森科技有限公司）转染重组子pLXSN-TERT至BMSCs，用G418于48 h后挑选TERT-BMSCs持续培育，2个月后检测TERT mRNA的表达和端粒酶活性，取对数成长期细胞与低熔点琼脂糖混合后接种，孵育4～6周后计数细胞克隆个数。C6胶质瘤细胞为阳性对照。
1.1.3动物模型 将64只健康的雄性Wistar大鼠（购自中国医学科学院动物实验室）作为动物模型目标，随机分为TBI组、BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组和对照组，每组各16只，四组大鼠每只体重约400 g。使用Marmarou办法制备TBI大鼠模型（详细办法：用分量450 g、直径18 mm的铜棒，笔直从1.2 m自在下落，撞击在大鼠冠状缝与矢状缝正中钢垫上，构成大鼠中度弥漫性TBI）。造模成功后24 h别离经鼠尾静脉注射移植1 ml体积的PBS、BMSCs（3×106/ml）、TERT-BMSCs（3×106/ml）。移植后7～9 d计算大鼠的存活量，然后将这些大鼠进行Morris水迷宫实验。
1.2检测办法
1.2.1 Morris水迷宫实验 水迷宫实验剖析设备购自上海欣软信息科技有限公司，包含定位飞行实验和空间探究实验，前者是记载躲避潜伏期，后者是记载在原渠道象限游水时刻[8]。大鼠经水迷宫测验后走心脏灌注4%多聚甲醛（上海翊圣生物科技有限公司）取脑，持续置入4%多聚甲醛中固定，在乳头体和视交叉处笔直堵截脑安排，惯例酒精梯度脱水、白腊包埋、切片。HE染色，封固。光镜下调查并拍片。
1.2.2大鼠脑皮层安排Western blot蛋白印迹法检测BDNF、NGF、Beclin1、Parkin蛋白表达水平 大鼠经水迷宫测验后断头处死，取脑，别离脑皮层安排，猝冷，取50 mg脑皮层安排，裂解、离心、取上清液，Bradford法测定蛋白浓度，上样、变性，取样品50 μg行蛋白电泳，将蛋白印记转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉关闭，参加一抗4℃过夜，洗膜后参加二抗，孵育，膜清洗后显色、显影。灰度扫描。
1.3评价目标
BMSCs外表标志物的判定；BMSCs转染TERT后端粒酶活性的判定：细胞克隆构成实验检测；大鼠学习回忆才能测验成果；大鼠脑皮层HE染色、光镜下调查成果；大鼠脑皮层安排BDNF、NGF、Beclin1、Parkin蛋白表达水平。
1.4计算学办法
选用SPSS 13.0计算学软件进行数据剖析，计量材料数据用均数±标准差（x±s）表明，多组间比较选用单因素方差剖析，组间两两比较选用Student′s t查验；以P<0.05为差异有计算学含义。
2成果
2.1 BMSCs外表标志物的判定
CD90、CD44和CD29符号阳性，CD45、CD34和CD31符号阴性。
2.2细胞克隆构成实验检测成果
BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组均没有细胞克隆构成，而且移植到大鼠后，大鼠均无逝世，24周后未见肿瘤构成。而C6胶质瘤细胞有很多细胞克隆，移植到大鼠体内具有相对安全性。
2.3大鼠学习回忆才能测验成果
在Morris水迷宫检测大鼠定位飞行实验中，TBI组与对照组比较，均匀躲避潜伏期延伸（P<0.05）。TERT-BMSCs-TBI组、BMSCs-TBI组与TBI组比较，均匀躲避潜伏期缩短（P<0.05）。在空间探究实验中，TBI组大鼠在原渠道象限的停留时刻显着较对照组大鼠缩短；而TERT-BMSCs-TBI组、BMSCs-TBI组与TBI组比较，在原渠道象限的停留时刻显着延伸（P<0.05）。成果提示，移植BMSCs后大鼠学习回忆才能显着改进，而移植转染TERT的BMSCs后，其改进更为显着（图1）。
*P<0.05
图1 各组大鼠水迷宫实验成果的比较
2.4大鼠脑皮层的HE染色、光镜下调查成果
對照组大鼠脑皮层神经细胞结构根本完好，核仁核膜清晰可见，核仁染色均匀，核膜完好，胞质染色呈均匀赤色。TBI组大鼠脑皮层见脑安排水肿，毛细血管扩张，神经细胞有变形坏死改动，胞核可见空泡化及核体舒展，胞浆气球样变及淡染。BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组与TBI组比较染色均有减轻，TERT-BMSCs-TBI组与BMSCs-TBI组比较染色减轻更显着。
2.5大鼠脑皮层安排Beclin1、Parkin、BDNF、NGF蛋白表达水平剖析
Western blot办法检测发现，BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组脑皮层安排Beclin1、Parkin、BDNF、NGF蛋白表达与TBI组比较均显着升高（P<0.05），TERT-BMSCs-TBI组比BMSCs-TBI组显着添加（P<0.05）（图2）。
*P<0.05
图2 各组大鼠脑安排Beclin1、Parkin、BDNF、NGF蛋白表达水平的比较
3评论
脑损害后为了保持身细胞自身的安稳会发作自噬，发作自噬时能够将现已损坏的细胞器经过溶媒途径解说，然后到达能量与蛋白的再循环[9]。Beclin1是自噬的调控基因[10]，是酵母自噬基因ATG6的同源物，也是哺乳动物参加自噬的特异性基因，首要调控自噬体的构成与老练[11]。线粒体自噬是自噬的一种，在脑安排中PINK1/Parkin信号通路参加了细胞内线粒体自噬进程，在铲除受损线粒体进程中发挥了重要效果[12]。Parkin分子定位到线粒体外膜对外膜蛋白进行泛素化润饰，介导受损线粒体被自噬体包裹而降解[13-14]。本研讨成果发现，TBI组大鼠经BMSCs、TERT-BMSCs移植后，Beclin1、Parkin的表达和大鼠学习回忆才能显着增强，其间TERT-BMSCs移植后增强更为显着。
BMSCs是现在医治脑损害的一个新的研讨方向，BMSCs能够在体表里诱导下排泄BDNF、NGF，还能够向神经元方向诱导转化，BDNF、NGF抵挡神经细胞损害，维护神经细胞，促进神经细胞的分解和再生，自身还可向神经细胞转化，对损害脑安排起修正效果。但BMSCs生计周期短，在移植后对损害脑安排的修正效果受限[15-16]。本研讨经过构建反转录病毒载体重组子pLXSN-TERT，取得TERT调控的BMSCs，防止细胞过度变老，安稳其在体表里的成长。研讨成果提示，TBI组大鼠经BMSCs、TERT-BMSCs移植后，BDNF、NGF的表达显着增强，其间TERT-BMSCs移植后表达增强更为显着。光镜下调查到，BMSCs-TBI组、TERT-BMSCs-TBI组与TBI组比较，脑细胞损害均有减轻，TERT-BMSCs-TBI组与BMSCs-TBI组比较减轻更为显着。
综上所述，TERT-BMSCs移植对TBI有显着的医治效果，促进脑损害后脑功用的重塑，促进学习回忆才能的增强。但对TBI恢复医治效果的详细机制是怎样的还有待进一步研讨。
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（收稿日期：2017-06-15 本文編辑：任 念）
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