孟敏君
[摘要]意图调查胰岛素对人乳腺癌细胞MCF-7中Erk信号通路的影响及其对MCF-7细胞增殖、侵袭和搬迁的影响。办法别离选用0、50、100和200nM不同剂量的胰岛素处理MCF7细胞0、24、48和72h，选用Western blot办法检测MCF-7细胞中Erk信号通路的磷酸化活化状况，选用MTT办法检测MCF-7细胞的增殖状况。通过创伤愈合试验和Boyden小室检测200nM胰岛素处理72h对MCF-7细胞侵袭和搬迁才能的影响。选用Erk信号通路按捺剂预处理MCF-7细胞，调查Erk信号通路在胰岛素促MCF-7细胞增殖、搬迁和侵袭才能中的效果。成果同0nM胰岛素处理组比较，不同剂量的胰岛素均可显着上调Erk的磷酸化水平，加强MCF-7细胞的增殖才能（P<0.05），且这种效果具有计量依赖性。同对照组比较，200nM胰岛素处理72h后，MCF-7细胞侵袭和搬迁才能均显着增强（f=188.000、95.640，P<0.05）。选用Erk信號通路阻断剂U0126阻断MCF-7细胞中的Erk信号通路后，胰岛素促MCF-7细胞增殖、搬迁和侵袭的才能显着下降（P<0.05）。定论胰岛素可通过激活MCF-7细胞中的Erk信号通路，增强肿瘤细胞的增殖、搬迁和侵袭才能。
[关键词]胰岛素；乳腺癌；MCF-7；增殖；搬迁
[中图分类号]R737.9
[文献标识码]B
[文章编号]2095-0616（2016）23-33-06
胰岛素可与胰岛素样成长因子-1受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）和胰岛素受体（insulin receptor，IR）及向下流传递活化信号，进而促进细胞的有丝分裂，胰岛素的这一效果促进研讨者们猜测其与肿瘤的发作开展是密不可分的。研讨成果证明，高胰岛素血症、2型糖尿病以及肥壮等代谢相关性疾病可导致肿瘤的发病危险显着升高。现在女人乳腺癌的发病率已成为女人恶性肿瘤中发病率最高的一种，而胰岛素作为一种成长因子，其在女人乳腺癌发病中的效果也得到相关文献的证明。而现在关于胰岛素参加乳腺癌发作开展中的机制研讨仍需求更深层次地探究。据此，本研讨等候通过调查胰岛素对人乳腺癌细胞MCF-7中Erk信号通路活化状况的影响及其对MCF-7细胞增殖、侵袭和搬迁的影响，开始评论胰岛素参加乳腺癌发作开展的机制。成果如下。
1.材料与办法
1.1细胞及试剂
首要由取中国医学科学院基础医学研讨所供给的人乳腺癌细胞株MCF7，然后选用DMEM培育基（含胎牛血清，浓度为10%）对其进行培育。一抗为鼠抗人p-Erk抗体，由深圳晶美生物科技有限公司供给；羊抗兔和羊抗鼠IgG（由辣根过氧化物酶符号）均购自Bio-Rad公司；Erk信号通路按捺剂、蛋白酶、CytoBuster蛋白、磷酸酶按捺剂购自Thermo公司；Boyden小室（用作侵袭试验）购自美国Millipore公司。
1.2研讨办法
1.2.1细胞处理办法别离选用不同浓度的胰岛素对受试细胞别离处理0、24、48和72h，其间胰岛素浓度别离为0、50、100和200nM。
1.2.2细胞总蛋白提取首要使用冰PBS对待检细胞接连两次洗刷，然后施行离心别离处理，离心加速度和时刻别离设置为400×g、5min；处理完结后在沉积中顺次参加蛋白酶、磷酸酶按捺剂，然后参加CytoBuster蛋白，剂量为100uL，将所得实践混合均匀后于25℃条件下孵育处理15min；再次行离心别离处理，离心加速度和时刻别离设置为12000×g、15min，温度为4°C。取上清液对蛋白浓度进行检测，另取部分上清液分装15uL，保存于-80℃恒温冰箱中。
1.2.3蛋白浓度测定首要选用BCA法测定：对规范品进行稀释处理，并依照50：1的体积比混合完结工作液的装备，在96孔板中别离参加200uL的规范工作液，并参加25uL待测样品或许规范品，每个待测标本均需求设置3个复孔。在37°C的条件下完结时长为30min的孵育处理，测定OD值后依据规范品所得成果制作规范曲线图，并据此推算出待测样品的水平。选用Western blot测定：将提取的蛋白经SDS-PAGE（浓度为8%-10%）和浓缩胶（浓度为5%）进行别离处理，待样品半干后需求将其转印到硝酸纤维素膜，并参加BSA（浓度为5%）进行时长为2h的关闭孵育，参加一抗后在4℃条件下孵育，时长为12h。次日选用TBST（浓度为0.1%）的溶液对膜片重复3次冲刷，每次冲刷时长均为5min。在待测样品中添加相应符号二二抗，25℃条件下进行时长为1h的关闭孵育。完结后选用TBST（浓度为0.1%）的溶液冲刷膜片，并使用深圳晶美生物科技有限公司供给的灵敏化学发光底物处理条带，以便显色。内参为Actin，判读成果。
1.2.4细胞增殖才能检测使用MTT办法：首要需求将处于杰出的对数成长期的细胞接种，并别离选用不同浓度的胰岛素滴入接种板孔中，孵育不一起刻。完结操作后均参加MTT溶液20uL，等候4h，将上清液彻底吸出后参加DMSO溶液15020uL，低速震动处理，时长为10min，测定OD值（490nm波长方位）。
1.2.5搬迁和侵袭强度检测选用创伤愈合试验办法：参照文献操作。将待检细胞首要选用台盼蓝染色计数处理，然后施行重悬干涉，取1×105个细胞于Boyden小室的上层，添加培育基直至整个体系为300uL，取500uL胎牛血清培育基（浓度为10%）于Boyden小室基层，上层和基层样品均孵育12h，使用棉拭子将未呈现侵袭的细胞除掉，取结晶紫（浓度为0.1%）对基层细胞施行固定染色处理，核算侵袭强度。最终，向含有待检样品的培育基中参加Erk信号通路阻断剂，剂量为U0126 10umol/L，调查并评价阻断状况。
1.3觀察目标
调查Western blot法测定不同浓度和时刻下胰岛素对MCF-7细胞增殖的影响，包含0、24、48和72h时0、50、100和200nM浓度下胰岛素间A值改变；调查MMT法测得不同浓度和时刻下胰岛素对MCF-7增殖指数的影响；比照胰岛素对MCF-7细胞搬迁和侵袭才能中的效果；比较不同处理方式下A值、细胞增殖指数、侵袭细胞数、切断宽度百分比数据。
1.4统计学剖析
选用SPSSl6.0软件，计量材料以（x±s）描绘量方式的数据，选用t查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2.成果
2.1Western blot法测定不同浓度和时刻下胰岛素对MCF-7细胞增殖的影响
每两个时刻和每两个浓度间A值比较差异均有统计学含义（P<0.05），其间A值跟着时刻的延伸和浓度的增高均不断添加，见表1～3、图1。
2.2MMT法测得不同浓度和时刻下胰岛素对MCF-7增殖指数的影响
每两个时刻和每两个浓度间细胞MCF-7增殖指数比较差异均有统计学含义（P<0.05），跟着时刻的延伸和浓度的添加，细胞增殖指数水平均不断升高，见表4、图2。
2.3胰岛素对McF-7细胞搬迁和侵袭才能中的效果
对照组与胰岛素组72h后搬运细胞数和侵袭细胞数均较0h显着增多（P<0.05），且72h胰岛素组搬运和侵袭细胞数均较对照组显着增多（P<0.05），见表5、图3。
2.4不同处理方式TA值、细胞增殖指数、侵袭细胞数、切断宽度百分比比较
对照组、胰岛素组、胰岛素+U0126组A值、细胞增殖指数、侵袭细胞数、切断宽度百分比两两比较差异均有统计学含义（P<0.05），见表6、图4。
3.评论
乳腺癌在全世界范围内的发作率均呈现出大幅添加的态势，虽然我国的发病率较低，可是添加
态势相对来说也比较显着。据相关材料显现，女人乳腺癌发病率在我国范围内现已跃居女人癌症的第1位。可知该病形势严峻，现已成为当时严重的公共卫生问题。可是此类病例的病因病机没有彻底清楚。近年来相关研讨通过对乳腺癌病例进行调查发现其间存在显着的规律性，也根本清晰了该病的高危要素。近年来的研讨成果显现，胰岛素或许与多种肿瘤的发作开展密切相关，提示胰岛素或许也会作为一种致病要素参加乳腺癌的发作和开展。
胰岛素作为一种多功能的蛋白质激素，在外可调理人体代谢，还可通过调理细胞有丝分裂促进细胞成长。本研讨发现以0、50、100和200nM的胰岛素及200nM的胰岛素处理MCF7细胞O、24.48和72h，MCF7细胞的增殖才能显着增强（P<0.05），与之前报导的胰岛素通过有丝分裂促进细胞成长相一致。此外，本研讨还证明，以200nM的胰岛素处理MCF-7细胞72h，MCF-7细胞的搬迁和侵袭才能均显着升高（P<0.05）。据此，上诉研讨成果提示，胰岛素可对乳腺癌病例肿瘤细胞的增殖、侵袭和搬运均起到巨大的推进效果，进而添加机体乳腺癌发作和恶化的危险。
胰岛素促细胞成长机制方面，Zhang等以为，胰岛素可通过激活P13K信号通路，然后影响肝星状细胞增殖。此外还有研讨以为胰岛素可对胰岛素样成长因子（insulin-like growth factor-1，IGF）受体的表达发作诱导，进而影响软骨细胞增殖。胰岛素作为一种成长因子在乳腺癌发作开展中的效果已日益得到必定。而关于胰岛素在乳腺癌发作和恶化过程中的机制没有彻底清楚。细胞外信号调理激酶1/2（extracellular-sigual regulated kinase 1/2，ERKl/2）是机体必不可少的物质，归于MAPK宗族成员，一旦成长因子、激素与神经递质受体结合能够激活该物质的磷酸化，促进活化的因子进入细胞核，进而参加细胞的增殖和分解。还有材料显现，选用Erk信号通路按捺剂U0126预处理MCF-7细胞后，再以200nM的胰岛素处理MCF-7细胞72h，癌细胞增殖、搬迁和侵袭才能则被显着按捺（P<0.01），提示胰岛素不只参加乳腺癌的发作，一起还可增强其增殖、侵袭及搬运强度，导致其预后更为恶化。
本研讨成果中，每两个时刻和每两个浓度间A值比较差异均有统计学含义（P<0.05），其间A值跟着时刻的延伸和浓度的增高均不断添加，阐明不同跟着时刻的延伸和胰岛素浓度的升高，MCF-7细胞中Erk信号通路则被显着阻断；每两个时刻和每两个浓度间细胞MCF-7增殖指数比较差异均有统计学含义（P<0.05），跟着时刻的延伸和浓度的添加，细胞增殖指数水平均不断升高，且对照组与胰岛素组72h后搬运细胞数和侵袭细胞数均较0h显着增多（P<0.05），且72h胰岛素组搬运和侵袭细胞数均较对照组显着增多（P<0.05），则阐明通过Erk信号通路按捺剂U0126预处理MCF-7细胞后，乳腺癌恶性肿瘤细胞增殖、侵袭、搬运强度则被显着按捺；最终对照组、胰岛素组、胰岛素+U0126组A值、细胞增殖指数、侵袭细胞数、切断宽度百分比两两比较差异均有统计学含义（P<0.05），证明胰岛素不只在乳腺癌的开展中有重要效果，也能显着增强其搬运和侵袭才能，而加用Erk信号通路按捺剂U0126后可显着按捺乳腺癌细胞的增殖、搬运和侵袭效果，与上述研讨定论相符合。
综上所述，胰岛素可激活MCF-7细胞中的Erk信号通路，提高其增殖、侵袭及搬运强度。但是是否还存在其他的信号通路参加调控胰岛素的促MCF-7细胞增殖、搬迁和侵袭才能还有待进一步的深入研讨。
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