周丹+++崔晓娴+++孙淑惠++蒋琳+++荣星喻+++汪慧菁+++赵超+++史虹莉
[摘要]意图 树立一种点评PBMC基因组DNA制备质量的简洁有用的办法。办法 本研讨选用实时定量PCR技能，对样本中的单复制基因36B4进行扩增，以调查扩增功率与样品质量之间的联系。成果 经DNase Ⅰ处理的基因组DNA中的36B4扩增功率显着低于未处理样品。选用该办法，对18份健康志愿者的血液标本基因组样品进行检测剖析，成果显现，其能够有用地点评血液标本基因组制备质量。定论 该办法可用于点评健康体检标本采会集的流程和操刁难体检的影响，进步触及基因组DNA检测体检项意图准确性。
[关键词]单复制基因；基因组DNA；血液标本；定量PCR
[中图分类号] R-331 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（a）-0004-04
[Abstract]Objective To establish a simple and effective method for evaluating the preparation quality of the genomic DNA from PBMC.Methods In this study，real-time quantitative PCR technique was used to amplify the single copy gene 36B4 in a sample to investigate the relationship between the amplification efficiency and the quality of samples.Results The amplification efficiency of 36B4 in the genomic DNA treated by DNase Ⅰ was significantly lower than that of the untreated sample.By using this method，the blood samples from 18 healthy volunteers were detected and analyzed，the results showed that the preparation quality of blood sample genome was effectively evaluated.Conclusion The method can be used to evaluate the influence of the process and operation on the physical examination in the sample collection of health examination，and to improve the accuracy of the test item of the genomic DNA.
[Key words]Single-copy gene；Genomic DNA；Blood sample；Quantitative PCR
细胞基因组DNA含有重要的遗传信息，经过检测基因组的DNA序列、复制数等信息，可供给细胞遗传和病理的信息，其被广泛运用于遗传病、肿瘤和变老等许多范畴。跟着精准医学的广泛运用，基因组DNA需求也越来越多[1]。制备好的基因组DNA相对较安稳，可长期寄存用于相关研讨。细胞收集、运送、保存到基因组制备操作进程等多个环节可影响DNA制备的质量，然后可能对后续检测，特别是定量检测成果发生影响。
点评基因组质量可为后续检测供给杰出保证，常用的DNA琼脂糖凝胶电泳办法可比较直观地调查DNA的降解状况，但敏感度较差。运用DNA在紫外波长区的吸光度（OD），测定OD260与OD280比值，能够断定DNA的纯度，运用OD260读数，能够较精确地定量DNA含量，可是由OD260的读数核算所得的基因组DNA含量包含了降解的DNA片段，并不能很好地反映基因组的质量。
基因组中含有单复制的基因，其与基因组DNA含量有较高的一致性，在基因组降解时，单复制的基因也相应降解。经过实时定量PCR技能检测单复制基因扩增功率，能够反映基因组降解状况，能够被用来作为点评基因组DNA质量的办法。本研讨选取编码酸性核糖体磷酸蛋白PO的36B4基因为意图基因进行扩增[2]，可有用点评制备的基因组DNA的质量。
1资料与办法
1.1全血基因组DNA制备
选用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒（Qiagen公司，Lot No.148030300）抽提EDTA抗凝全血中外周血单核淋巴细胞（PBMC）的基因组DNA，办法见操作阐明。扼要进程：20 μl蛋白酶K消化液参加溶解于200 μl PBS的PBMC细胞悬液，56℃恒温水浴锅中消化10 min，参加200 μl无水乙醇充沛混匀后过柱，再别离用500 μl AW1和AW2洗刷1次，晒干后用100 μl超纯水溶解DNA。
1.2 DNase Ⅰ处理DNA样品
取Takara公司DNA酶Deoxyribonuclease Ⅰ（DNase Ⅰ，Lot No.CE5301A）0.7 U参加1 μg DNA样品，25℃孵育，别离处理1、5、15 min，处理后经Qiagen DNA纯化试剂盒纯化收回。
1.3分光光度仪定量DNA含量
选用Epoch微孔板分光光度计（BioTek公司）对基因组DNA进行定量，并读取OD260/OD280读数，以点评DNA纯度，并对DNA进行定量。
1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳
选用1%琼脂糖凝胶电泳，每孔上样量200 ng，条件为100 V恒压，45 min，经复日科技凝胶成像系统成像。选用Takara公司DL5000（M5 kb）、DL15000（M15 kb）DNA marker作为分子量参照。
1.5实时定量PCR检测
PCR系统的组成：150 nmol/L 6-ROX，0.2×Sybr Green Ⅰ，15 nmol/L Tris-HCl（pH=8.0），50 nmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，dNTP各0.2 mmol/L，5 mmol/L DTT，1% DMSO以及1.25 U GoTaq Gold DNA 多聚酶（Promega公司）[3]。基因组DNA模板40 ng，引物浓度0.5 μmol/L，反响系统体积20 μl。反响条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，58℃延伸1 min（35个循环）。标准曲线为一份抽提的基因组DNA依照梯度稀释，最高浓度42 ng，顺次依照1.68倍等比稀释。
引物由生工生物工程上海有限公司组成，序列[4]如下：
36B4u，CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC；
36B4d，CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA。
2成果
2.1琼脂糖凝胶电泳较难分辩降解条带
经DNA酶（DNase Ⅰ）处理的基因组DNA很快被降解成小片段。琼脂糖凝胶电泳图（图1A）能够看到，在相同上样量条件下，基因组DNA主条带含量下降，但并未见到显着的拖尾现象。相同，未被及时处理的抗凝血标本中，也发现在相同上样量条件下，基因组DNA主条带含量下降，而并未见到显着的拖尾现象。原因在于DNA被降解成过小片段，加之凝胶成像分辩率有限，难以被该办法显现出来（图1B）。
M15 kb和M5 kb别离为分子量参照。A中为基因组DNA未经DNase Ⅰ处理和别离处理1 min（D1）、5 min（D5）和15 min（D15）的电泳图。B为同一份血清马上抽提（G1）、4℃冷藏放置24 h（G2）和室温放置24 h（G3）后抽提的基因组DNA
2.2运用实时定量PCR法扩增标本中的34B4基因可点评DNA质量
凭借标准曲线，实时定量PCR法可对样本中的意图基因进行定量，敏感度较高。运用该技能扩增标本中的34B4基因，能够反映出完好的基因组DNA的含量，用此数据能够点评DNA质量凹凸。对来自同一份健康志愿者的抗凝血在不同条件下抽提，或加DNase Ⅰ处理后，在相同条件下进行扩增，制作阈值循环数（Ct）-浓度（以2为底的对数值）曲线（图2）。成果显现，马上抽提组（G1）的扩增功率最高，经DNase Ⅰ处理的基因组DNA的Ct值显着升高（D1和D5），而D15组已不能有用扩增出意图基因。相对于G1组，4℃冷藏放置24 h（G2）和室温放置24 h（G3）后抽提组的Ct值添加，提示扩增功率下降，DNA发作降解。这阐明该办法可活络地分辩出基因组DNA的降解状况，进而点评DNA质量。
G1、G2、G3、D1、D5和D15组PCR检测开始上样量均为40 ng，Ct值顺次升高，D15组未能检测出。横坐标为DNA含量单位纳克（ng），以Log2数值显现，纵坐标为阈值循环数（Ct值）
2.3在实践样本中34B4基因扩增功率反映基因组DNA制备质量
选取18份健康志愿者抗凝血，抽提基因组DNA，运用定量PCR扩增34B4基因，制作阈值循环数（Ct）-浓度（以2为底的对数值）曲线（图3）。成果显现，13份标本较好地契合标准曲线，5份发生违背，提示不同的标本基因组DNA质量存在差异。该办法适用于临床实践标本的点评。
3评论
跟着精准医学在健康办理中的运用，越来越多的基因组DNA标本被用于研讨[5-7]。基因组的质量受多个环节影响，包含样本收集、运送、贮存、后续制备等。对DNA质量进行科学活络的点评，能够对样本处理环节的影响进行点评，进而发现影响样本质量的要素，促进样本处理办法的改善，因而，开发简略有用的点评办法显得尤为重要。基因组DNA以双链环绕组蛋白的方式构成染色体，存在于细胞核内。基因组DNA制备进程中，需裂解细胞膜和细胞核膜，去除蛋白质和RNA搅扰[8]。基因组DNA分子量大，易受机械剪切影响，因而，样本取放时应该分外留意[9-10]。基因组DNA样品也受多要素影响，包含储运条件、重复冻融、标本污染等，所以，标准化的流程和全程的办理并合作简洁易行的点评手法是保证后续试验成功的必要条件。
单复制基因含量在基因组中安稳，与完好的基因组含量成正比。当基因组DNA受损后，单复制基因也会随机被降解，导致其扩增功率低于完好基因组DNA。实时定量PCR成果显现，其扩增的Ct值变大[11]。本研讨成果显现，长期放置的抗凝血标本扩增功率下降，而琼脂糖凝胶电泳图中未见显着降解条带，原因是因为后者的分辩率缺乏。运用DNase Ⅰ处理基因组DNA，作为降解的阳性对照，经过琼脂糖凝胶电泳显着可见DNA降解图形，对应的PCR扩增功率显着下降，而且与凝胶成果正相关，这阐明该办法是一种活络牢靠的点评DNA降解的办法。现在常用的可供挑选的单复制基因有36B4、β-globin等[12-13]。本研讨也发现运用不同单复制基因扩增对应的点评作用相似。
实时定量PCR法用于意图基因的扩增，具有线性规模广、重复性好、易于批量化等长处，适合在临床科室中推行运用。现在，许多医院检验科和中心试验室现已装备实时定量PCR仪，所以该办法的可移植性好。而其缺陷同一般PCR（如易污染，过于活络）相似，但能够经过严厉标准操作程序和选用复孔等办法防止[14]。
本办法能够作为点评基因组DNA质量的简略牢靠的办法，具有快捷牢靠的特色，易于在健康办理和临床实践中推行运用，特别是对基因组DNA质量要求较高的研讨，如基因复制数、端粒检测等[15-16]。
[参考文献]
[1]Kibriya MG，Jasmine F，Roy S，et al.Measurement of telomere length：a new assay using QuantiGene chemistry on a Luminex platform[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2014， 23（12）：2667-2672.
[2]Akamine R，Yamamoto T，Watanabe M，et al.Usefulness of the 5′ region of the cDNA encoding acidic ribosomal phosphoprotein P0 conserved among rats，mice，and humans as a standard probe for gene expression analysis in different tissues and animal species[J].J Biochem Biophys Methods，2007，70（3）：481-486.
[3]Fang C，Zhao C，Liu X，et al.Protein alteration of HepG2.2.15 cells induced by iron overload[J].Proteomics，2012，12（9）：1378-1390.
[4]Cawthon RM.Telomere measurement by quantitative PCR[J].Nucleic Acids Res，2002，30（10）：e47.
[5]Kimura M，Stone RC，Hunt SC，et al.Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths[J].Nat Protoc，2010，5（9）：1596-1607.
[6]Lin Y，Damjanovic A，Metter EJ，et al.Age-associated telomere attrition of lymphocytes in vivo is co-ordinated with changes in telomerase activity，composition of lymphocyte subsets and health conditions[J].Clin Sci （Lond），2015，128（6）：367-377.
[7]Edson SM，McMahon TP.Extraction of DNA from skeletal remains[J].Methods Mol Biol，2016，1420：69-87.
[8]Dapprich J，Ferriola D，Mackiewicz K，et al.The next generation of target capture technologies-large DNA fragment enrichment and sequencing determines regional genomic variation of high complexity[J].BMC Genomics，2016，17（1）：486.
[9]Melendez JH，Santaus TM，Brinsley G，et al.Microwave-accelerated method for ultra-rapid extraction of Neisseria gonorrhoeae DNA for downstream detection[J].Anal Biochem，2016，510：33-40.
[10]Vaudano E，Costantini A，Garcia-Moruno E.An event-specific method for the detection and quantification of ML01，a genetically modified Saccharomyces cerevisiae wine strain，using quantitative PCR[J].Int J Food Microbiol，2016，234：15-23.
[11]Al-Harti SA.Assessment of three blood genomic-DNA preparation methods for malaria molecular diagnosis[J].J Egypt Soc Parasitol，2016，46（1）：1-8.
[12]Zhang WX，Fan J，Ma J，et al.Selection of suitable reference genes for quantitative real-time PCR normalization in three types of rat adipose tissue[J].Int J Mol Sci，2016，17（6）：E968.
[13]Cawthon RM.Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method[J].Nucleic Acids Res，2009，37（3）：e21.
[14]Tian X，Zhao C，Ren J，et al.Gene expression profiles of a hepatitis B small surface antigen secreting cell line revealed up-regulation of lymphoid enhancer-binding factor 1[J].J Gen Virol，2007，88（Pt 11）：2966-2976.
[15]Chen G，Lustig A，Weng NP.T cell aging：a review of the transcriptional changes determined from genome-wide analysis[J].Front Immunol，2013，4：121.
[16]Meena JK，Cerutti A，Beichler C，et al.Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress，senescence and cell depletion[J].EMBO J，2015，34（10）：1371-1384.
（收稿日期：2016-07-19 本文修改：祁海文）
根据您访问的内容，您可能还对以下内容感兴趣，希望对您有帮助：