鲁义++++++姚嘉茵++++++尧新华++++++卿朝晖++++++童辉4++++刘玲
[摘要] 意图 评论Toll样受体4（TLR4）抑制剂TAK-242对糖尿病周围神经痛（DPN）模型大鼠的医治作用及其可能的作用机制。 办法 SPF级雄性SD大鼠60只，随机均分为3组，别离为正常对照组（NC组）、DPN模型组（DPN组）、TAK-242医治组（TAK组）。选用链脲佐菌素（STZ）办法树立DPN大鼠模型，选用ELISA及RT-PCR办法检测DPN模型大鼠腰膨大脊髓安排的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）-TLR4轴上下流基因（HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB、IL-6）的改动，剖析上述细胞因子表达水平与大鼠痛苦行为的相关性。运用TLR4抑制剂TAK-242对DPN模型大鼠进行药物干涉，调查其医治作用及对HMGB1-TLR4轴基因表达的影响。 成果 ELISA检测显现，DPN组大鼠的血清HMGB1、TLR4、IL-6表达水均匀较NC组升高（P<0.05）；TAK组大鼠的TLR4及IL-6表达水平较DPN组下降（P<0.05）。RT-PCR检测显现，DPN组大鼠的HMGB1、TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表达水平较NC组升高（P<0.05）；TAK组大鼠的TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表达水平较DPN组下降（P<0.05）。 定论 TLR4抑制剂TAK-242经过阻断HMGB1-TLR4轴对DPN模型动物起医治作用。
[关键词] TLR4；TAK-242；HMGB1-TLR4；糖尿病周围神经痛
[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）02（a）-0009-04
Therapeutic effect of TAK-242 on diabetic peripheral neuropathic pain rats
LU Yi1 YAO Jia-yin2 YAO Xin-hua1▲ QING Zhao-hui1 TONG Hui1 LIU Ling1
1.Department of Anesthesiology，Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130，China；2.Department of Gastroenterology，the Sixth Hospital Affiliated to Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510655，China
[Abstract] Objective To investigate the therapeutic effect and possible mechanisms of TLR4 inhibitor named TAK-242 on the diabetic peripheral neuropathic （DPN） rat model. Methods 60 male SD rats with SPF level were randomly divided into 3 groups， such as normal control group （NC group）， DPN model group （DPN group），TAK-242 treatment group （TAK group）.DPN rat models were established by using the method of streptozocin （STZ），and behavior analysis were made.Expressions of HMGB1-TLR4 related genes such as HMGB1，TLR4，MAPK，NF-κB and interleukin-6 （IL-6） were determined by RT-PCR.Correlations of genes mentioned above and the pain behavior of rats were analyzed.TLR4 inhibitor named TAK-242 was used for drug intervention.Its therapeutic effect and the effect on the expressions of HMGB1-TLR4 axis were observed. Results There was a significant increase in the spontaneous behavior and decrease in the pain threshold of rats in DNP group compared with NC group （P<0.05）.The serum expression of TLR4 and IL-6 in DNP group was significantly higher than those in NC group （P<0.05），and the expression of IL-6 and TLR4 in the TAK group was decreased compared with the model group as detected by ELISA （P<0.05）.The expressions of HMGB1，TLR4，NF-κB and IL-6 mRNA in DNP group was significantly higher than those in NC group （P<0.05），and the mRNA expression of TLR4，NF-κB and IL-6 in TAK group was decreased compared with DNP group as detected by RT-PCR （P<0.05）. Conclusion By blocking the HMGB1-TLR4 axis，TLR4 inhibitor TAK-242 plays a role of therapeutic effect in the treatment on DPN rats.
[Key words] TLR4；TAK-242；HMGB1-TLR4；Diabetic peripheral neuropathic
在糖尿病患者中约20%的患者兼并有糖尿病周围神经病变，占糖尿病神经病变的50%[1-2]，其间糖尿病周围神经痛（diabetic peripheral neuropathy，DPN）发病率为13%～26%[3-4]。最新研讨以为DPN的发作、开展与全身缓慢炎性反响密切相关，特别周围神经部分免疫功用反常、细胞因子信号传导轴反常相关[5]。其间，高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）-Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）轴可能是神经免疫性损害的中心病因[6]。本研讨拟评论HMGB1-TLR4轴在DPN发病机制中的作用，运用TLR4抑制剂TAK-242阻断HMGB1-TLR4轴，调查其对DPN的医治作用。
1 材料与办法
1.1 试验动物
雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量180～220 g，由中山大学痛苦医治中心供给；安排专人选用专用饲料和水进行喂食。试验动物质量合格证：SCXK（粤）2009-0011。试验动物设备运用证：编号0044336。
1.2动物分组
60只大鼠随机均分为3组，别离设为正常对照组（normal control group，NC组）、DPN模型组（DPN model group，DPN组）、TAK-242医治组（TAK-242 treatment group，TAK组）。
1.3动物模型的树立
选用链脲佐菌素（STZ）法树立模型。大鼠自动物试验中心取回，禁食不由水24 h。大鼠禁食12 h后称重，依照55 mg/kg一次性腹腔打针STZ溶液（美国Sigma公司）。腹腔打针48 h后用血糖剖析仪测定大鼠尾静脉血糖，空腹血糖>16.7 mmol/L的大鼠为成功的DPN模型大鼠，共得到40只（其间DPN组20只，TAK组20只）。正常对照组则腹腔打针相同剂量枸橼酸/枸橼酸钠缓冲液，共得到20只。
1.4 干涉办法
TAK组大鼠，在造模前1天，造模后第1、7天别离按大鼠体重给予腹腔打针3 mg/kg TAK-242[4]（购自美国Takeda公司）。NC组与DPN组别离在相同时刻腹腔打针3 mg/kg的生理盐水。造模后第14天完毕试验，一切大鼠均麻醉下处死，心脏打针取血，离心后取血清至-4℃冰箱贮存；快速取出腰膨大，运用4%多聚甲醛固定，预备行免疫组化检测。留取腰膨大安排2～3 g，置于去RNA酶的Eppendorf管中，经液氮后转至-70℃冰箱，用于RT-PCR检测。
1.5行为学剖析
调查大鼠有无自发性痛苦行为。造模后第1、7、14天，在室温（24±1）℃的舒适、安静环境下调查大鼠的歩态和后肢的抬脚、护卫姿态、舔脚、腿的着地性或抗重力行为，以及是否有自残形为。
1.6 ELISA检测
根据试剂盒阐明书操作（HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB及IL-6的ELISA试剂盒，均购自美国Invitrogen公司）。检测各组大鼠血清HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB及IL-6的含量水平。
1.7 RT-PCR
取大鼠腰膨大脊髓安排，按Trizol试剂阐明书提取肝脏总RNA。选用紫外分光光度计测定总RNA样品的浓度和纯度。取2 g总RNA为模板，回转录成cDNA。PCR反响条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火59℃ 30 s。延伸72℃ 1 min。30个循环后，72℃再延伸10 min。再取5 μl PCR反响产品，1.5%琼脂糖凝胶电泳摄影。选用Quantity One软件核算待测蛋白的基因和β-actin扩增片断的扫描密度比值。
1.8计算学办法
选用计算软件SPSS 13.0对试验数据进行剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）标明，组间差异选用单因素方差剖析，以P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 各组大鼠的一般状况
NC组大鼠毛色有光泽，精力好，爱活动，食量、粪便均正常。DPN组大鼠自试验造模后，活动量削减，精力精神萎顿。TAK组大鼠活动稍差，毛色稍暗，大小便无反常，均无逝世。
2.2各组大鼠行为学的改动
DPN组大鼠自造模第2天开端呈现痛觉步态，采纳护卫姿态、舔脚等自发行为，造模第14天到达顶峰。TAK组大鼠自发行为较DPN组少，第3次打针干涉药物后自发行为显着削减。各组大鼠试验进程没有调查到大鼠有自残行为。
2.3 各组大鼠血清中HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB、IL-6的表达量测定
DPN组大鼠血清中的HMGB1、TLR4、IL-6 mRNA表达均较NC组升高，差异有计算学含义（P<0.05）。TAK组的TLR4、IL-6 mRNA表达较DPN组下降，差异有计算学含义（P<0.05）。 三组大鼠的MAPK、NF-κB mRNA表达差异无计算学（P>0.05）（图1）。
2.4 各组大鼠腰膨大脊髓安排中HMGB1、TLR4、MAPK、NF-κB、IL-6 mRNA的表达量测定
DPN组的HMGB1、TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表达均较NC组升高，差异有计算学含义（P<0.05）。TAK组的TLR4、NF-κB、IL-6 mRNA表达较DPN组下降，差异有计算学含义（P<0.05）。各组大鼠的MAPK mRNA表达差异无计算学含义（P>0.05）（图2）。
3 评论
现在普遍以为DPN的发病与高血糖及由此带来的一系列代谢紊乱关系密切。国内外研讨也标明该病的发作、开展与全身缓慢炎性反响密切相关，特别与周围神经部分免疫功用反常、细胞因子信号传导轴反常相关[7-8]。
HMGB1是关节炎、癌症、本身免疫性疾病和糖尿病发病的关键性中心物质。研讨标明，HMGB1在糖尿病患者血浆中水平较高，且HMGB1表达水平与血糖水平凹凸呈正相关[9-10]。TLR是宿主反抗病原菌侵略的首要辨认和信号传递受体，而TLR4基因缺失小鼠，其神经超敏性下降、脊髓胶质细胞活性和促炎性因子表达也下降[11-12]。在核内，HMGB1与DNA结合，活化下流两种不同信号通路激活——MAPK，NF-κB通路。NF-κB的活化引起IL-6等促炎症因子的组成和开释，如TNF-α和IL-1β，而MAPK通路激活在调理神经元重塑方面有重要作用[13-15]。本研讨显现，DPN模型大鼠中血清中的HMGB1、TLR4、IL-6表达量及mRNA表达水均匀较NC组升高，差异有计算学含义（P<0.05），阐明HMGB1-TLR4在DNP的发病机制中起重要作用。
现阶段，DPN的医治手法十分有限，在操控血糖的基础上，传统医治药物包含抗抑郁药、抗惊厥药、抗痉挛药及其他改进部分血流的药物联合运用[16-18]。近年来，比较受重视的是靶向医治[19-20]。笔者选用TLR4抑制剂TAK-242对大鼠进行干涉，成果显现TAK组的大鼠体内TLR4、IL-6 mRNA较DPN组下降，提示TLR4抑制剂TAK-242能够有用阻断HMGB1-TLR4，中止促炎因子的开释及其对机体的损害，估测可将其作为一种有用的分子靶向医治办法，为临床医治药物的研讨与拓宽供给试验根据。
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（收稿日期：2015-10-30 本文修改：卫 轲）
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