赵瑞柯+曹俊华
[摘要]意图 树立反相高效液相色谱法一起测定血浆中茶碱和多索茶碱的浓度。办法 色谱柱为Phenomenex C18 柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），活动相为甲醇∶水（30∶70）；流速为1 ml/min；检测波长为273 nm，内标为咖啡因。成果 茶碱和多索茶碱在1.05～67.33 μg/ml的浓度规模内线性关系杰出（r>0.999）；茶碱和多索茶碱的办法回收率别离为96.79%～105.40%、91.85%～95.51%， 日内、日间相对规范偏差（RSD）均<10%。定论 本办法简略、精确，适用于一起测定茶碱和多索茶碱的血药浓度。
[关键词]茶碱；多索茶碱；血药浓度监测；反相高效液相色谱法
[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）1（c）-0007-03
Simultaneous determination of the concentration of Theophylline and Doxofylline in human plasma by revered-phase high performance liquid chromatography
ZHAO Rui-ke1 CAO Jun-hua2
1.Department of Pharmacy，Traditional Chinese Medcine Hospital of Changsha City in Hu′nan Province，Changsha 410100，China；2.Department of Pharmacy in Mawangdui Area，People′s Hospital in Hu′nan Province，Changsha 410000，China
[Abstract]Objective To establish a method for simultaneous determination of theophylline and doxofylline in human plasma by RP-HPLC.Methods Phenomenex C18 （250 mm ×4.6 mm，5 μm） column was used.The mobile phase was composed of methanol-water （30∶70） at flow rate of 1.0 ml/min.The detection wavelength was 273 nm and the internal standard was caffeine.Results The linear range was 1.05 to 67.33 μg/ml for theophylline and doxofylline （r>0.999）.The recovery rates was 96.79%-105.40% and 91.85%-95.51% respectively.The intra-day precisions and the inter-day precisions were both less than 10%.Conclusion The method is rapid and accurate.It can be used for the simultaneous determination of theophylline and doxofylline concentration in human plasma.
[Key words]Theophylline；Doxofylline；Plasma concentration monitoring；RP-HPLC
茶堿是临床上医治支气管哮喘的经典药物，其经过按捺磷酸二酯酶，使细胞内环磷酸腺苷（cAMP）含量增高而发挥药理效果。茶碱的有用血药浓度与中毒浓度十分挨近，因而临床运用需求监测其血药浓度[1]。多索茶碱是新式的甲基黄嘌呤衍生物，其支气管平滑肌松懈效果是茶碱的10～15倍，并有镇咳效果。多索茶碱的毒副效果较茶碱少，可是大剂量仍可引起血压下降等不良反应[2-3]。现在茶碱和多索茶碱的血药浓度测定多有报导，可是一起测定的文献较少。茶碱和多索茶碱互为补充，临床上存在着两者替换运用乃至兼并运用的状况[4-6]。本研讨树立了反相高效液相色谱法一起测定血浆中茶碱和多索茶碱的药物浓度，现报导如下。
1仪器与资料
1.1仪器
LC-10A高效液相色谱仪，SPD-10A紫外检测器，Shimadzu CLASS-VP液相工作站（日本岛津）；梅特勒-托利多AG285电子剖析天平（瑞士，精度：0.01 mg）；TG16-W 微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；WH-2 微量旋涡混合仪（上海沪西剖析仪器厂）。
1.2药品与试剂
氨茶碱对照品（我国药品生物制品检定所，批号：100336-200703，含量为99.9%），多索茶碱对照品（我国药品生物制品检定所，批号：100109-200305，含量为99.9%），咖啡因对照品（内标，我国药品生物制品检定所，批号：100757-200556，含量99.1% ）， 甲醇（色谱纯，Merck，Germany），水为两层蒸馏水，其他试剂为剖析纯。
2办法与成果
2.1色谱条件
色谱柱：Phenomenex C18 柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），预柱：Phenomenex C18柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40℃；活动相：甲醇∶水（30∶70）；流速：1 ml/min；检测波长：273 nm；进样量：10 μl。endprint
2.2规范溶液的制备
精细称取氨茶碱对照品10.1 mg 、多索茶碱对照品10.1 mg，置于10 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成10.10 μg/ml的对照品储藏液；另精细称取咖啡因对照品10 mg，置于100 ml 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得浓度为100 μg/ml的内标溶液。以上样品均置于4℃的冰箱保存备用。
2.3血浆样品的处理
取血浆0.35 ml，置于1.5 ml的EP管中，参加内标溶液25 μl，再参加甲醇溶液1.1 ml，涡旋振动1 min，以10 000 r/min离心10 min，取上清液10 μl进样。
2.4色谱行为
空白血样、空白血样中参加对照品和内标血样经HPLC剖析得到色谱图（图1）。茶碱、多索茶碱和内标的保存时刻别离为7.1、13.8、9.6 min，基线平稳，峰形杰出，无杂质峰搅扰。提示本办法具有较高特异性，能够精确测定血浆中茶碱和多索茶碱的浓度。
2.5线性规模与最低检测限
用空白血浆将茶碱对照品和多索茶碱对照品溶液稀释成不同浓度（1.05，2.11，4.21，8.42，16.83， 33.66，67.33 μg/ml）的含药血浆，按“2.3”项下处理办法处理并测定，以茶碱、多索茶碱的峰面积和内标的峰面积比值与茶碱和多索茶碱的浓度进行线性回归，别离得到回归方程为Y=18.591X-0.457（r2=0.9987）、 Y=17.362X-0.256（r2=0.9963），成果提示茶碱和多索茶碱在1.05～67.33 μg/ml规模内线性关系杰出，最低定量限为1.05 μg/ml。
2.6回收率与精细度实验
别离制造浓度为2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶碱和多索茶碱的血浆样品规范管，按 “2.3”项下操作，测定峰面积，按回归方程核算实测浓度，别离在同一天内测定5次和每天5次接连测定3 d，别离调查办法的日内、日间精细度和回收率。
装备浓度为2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶碱和多索茶碱规范液各5份，直接进样得峰面积。用空白血浆装备不同浓度的茶碱、多索茶碱规范血浆各5份，平行操作，进样得峰面积。将萃取前后的峰面积进行比较，核算办法的提取回收率（表1）。
2.7样品稳定性调查
血浆样品室温放置稳定性：用空白血浆制造相当于浓度2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶碱和多索茶碱的血浆样品，调查其在-20℃冷冻保存、重复冻融、室温条件下的稳定性。成果提示，茶碱和多索茶碱的血浆样品在-20℃保存20 d，重复冻融3次，室温条件下放置10 h，测得的浓度与理论浓度比较，RSD均<10%，提示茶碱和多索茶碱在上述条件下保持稳定（表2）。
2.8临床运用
患者，男，73岁，确诊：缓慢阻塞性肺疾病急性加剧，高血压3级（极高危）。入院后医嘱给予患者氨茶碱注射液0.25 g和0.9%氯化钠注射液250 ml静脉滴注，12 h给药1次。第4天测定茶碱谷浓度为17.3 μg/ml，患者已有较显着的厌恶吐逆等中毒症状。医师调整遗言，改为多索茶碱0.2 g和0.9%氯化钠注射液250 ml静脉滴注，12 h给药1次，第8天给药前测定多索茶碱谷的浓度为8.46 μg/ml ，患者哮喘操控佳，且無不良反应发作。
3评论
现在国内外报导的茶碱和多索茶碱HPLC一起测定的办法主要有固相提取法[7]、液液萃取法[8]、直接蛋白沉淀法[9-15]等。固相提取法操作进程繁琐，液液萃取法一般选用的氯仿、异丙醇等易挥发试剂，对身体有较大毒性，且进程需求萃取、搬运、挥干等，操作一致性和稳定性较差。罢了有的蛋白沉淀法，多选用10%三氯醋酸、10%高氯酸等，上清液需用微孔滤膜过滤，活动相中参加三乙胺等改进拖尾。本法沉淀剂选用甲醇，活动相选用甲醇-水，对色谱柱损害较小。
多索茶碱与茶碱在化学结构上的区别是多索茶碱在茶碱的7位上加了1个二氧戊环，这是两者在色谱柱上能够别离的根底，多索茶碱的保存时刻比茶碱延长了许多。活动相中有机相与水相的份额对茶碱和多索茶碱的保存时刻有很大的影响，本研讨调查了甲醇与水的不同配比，当甲醇份额>35%时，茶碱色谱峰和血浆内源性杂质峰无法别离。当甲醇∶水的份额为3∶7时，茶碱、多索茶碱、内标与杂质峰别离效果较好，出峰时刻适合，满意了测定需求。
以往以为茶碱的有用医治浓度规模是10～20 μg/ml，近些年研讨发现茶碱在低浓度（5～10 μg/ml）时有明显的抗炎效果及免疫调节效果，故把茶碱的有用血药浓度定为6～15 μg/ml更合理，该浓度统筹了茶碱的扩张支气管和抗炎效果，又削减了毒性效果的发作[16-18]。多索茶碱的有用药物浓度仍无统一规范，但考虑到多索茶碱的药理效果是茶碱的10～15倍，在<5 μg/ml时是否有临床意义还需进一步研讨。本办法的测定规模（1.05～67.33 μg/ml）彻底覆盖了最低有用浓度和中毒浓度，能够满意临床测定的需求。
现在在临床医治上，为了操控哮喘的急性症状，口服多索茶碱的患者仍可能静脉注射茶碱注射液，运用本办法可一起快速精确地测定茶碱和多索茶碱的血药浓度，为临床及时调整剂量、削减不良反应的发作供给根据。
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（收稿日期：2017-09-04 本文修改：闫 佩）endprint
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