王志宏+丁莹莹+冯娇娇+李连青+潘卫+郭存九
[摘要] 意图 构建重组质粒柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）VP1，并进行原核表达及判定。办法 用PCR办法扩增CA16 VP1序列，构建其重组表达质粒pET21b-CA16 VP1，并转入大肠杆菌E. coli BL21（DE3）进行诱导表达及纯化，SDS-PAGE判定表达及纯化产品，直接ELISA办法检测重组蛋白CA16 VP1的抗原性和有用性。成果 成功原核表达并纯化了CA16 VP1蛋白，可与小鼠抗CA16病毒血清特异性结合，与太原市晚年人群中部分血清存在高反响性。 定论 CA16 VP1蛋白获得成功表达，ELISA检测具有杰出的抗原性和有用性，为CA16确诊试剂盒的研讨奠定根底。
[关键词] 柯萨奇病毒A组16型；VP1蛋白；原核表达；酶联免疫吸附
[中图分类号] R373.2；R392-33 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）14-0069-04
手足口病（Hand foot and mouth disease，HFMD）是一种全球性的盛行症，自1957年新西兰初次报导以来[1]，世界各地均有不同程度的盛行[2-5]。近年来，手足口病疫情呈不断上升的趋势，尤其在亚太地区。2008年，我国将其列为法定丙类盛行症进行监测，现在 HFMD的发病率和逝世率在丙类盛行症中仍居首位。引起HFMD的肠道病毒有20多种，其间柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）和EV71最为常见[6]，其他肠道病毒像CA4、CA5、CA9、CA10、CB2和CB5也可以引起[7]。CA16 基因组全长7410 bp，其间VP1基因长891 bp，编码297个氨基酸残基[8]，CA16 VP1含有许多线性中和表位，VP1基因与肠道病毒血清型彻底对应，可作为肠道病毒属内不同血清分类依据，也可作为小RNA病毒科分类依据[9]。因而，CA16 VP1基因已成为研讨CA16的重要目标。本试验旨在构建pET21b-CA16 VP1重组表达质粒，在大肠杆菌华夏核表达并纯化CA16 VP1重组蛋白，并检测其抗原性和有用性，为CA16确诊试剂盒的研讨奠定根底。
1 资料与办法
1.1 质粒、菌株、细胞、病毒及试剂
原核表达载体pET21b购自Novagen公司，大肠杆菌（E. coli）BL21（DE3）和Top10菌株购自TAKARA公司。CA16病毒和RD细胞由上海市疾病防备控制中心供给。限制性核酸内切酶BamH I、HindIII和DNA Marker（DL2000）购自宝生物工程（大连）有限公司；Taq DNA 聚合酶试剂盒购自天根生化科技有限公司；T4 DNA衔接酶（Ligation High kit）购自东瀛纺（我国上海）生物科技有限公司；PCR小量胶收回试剂盒购自北京天恩惠科技有限公司。金属螯合亲和层析介质（Ni-NTA）购自德国QIAGEN公司。重组质粒pET32a-CA16 VP1、纯化的pET32a蛋白和LD5由第二军医大学病原生物学教研室制备并保存，其间LD5为一种新式免疫球蛋白结合分子（NEIBM），可与Ig的VH3和Vk区域双结合，与IgG有较高的亲和力[10-12]。
1.2 试验动物及血清标本
清洁级BALB/C小鼠，雌性，6周龄，16～18 g，由第二军医大学试验动物中心供给；2013年5月29日～5月30日山西医科大学第二隶属医院查验科95份太原市晚年人血清，其间男48例，女47例，平均年龄（61.0±14.0）岁。
1.3 引物的规划及组成
依据CA16 VP1基因（NCBI 登录号：AEO12126.1）序列自行规划引物，上游P1：5′-GGCCCGGGGATCCGGGTGACCCGATCGCTGAC-3′（下划线部分为BamH I酶切位点），下流P2：5′-CGCCCGCGGAAGCTTCAGAGTAGTGATTTTGTC-3′（下划线部分为Hind III酶切位点），扩增片段巨细为891 bp。引物由上海生工生物有限公司组成。
1.4 CA16 VP1基因的扩增
以pET32a-CA16 VP1质粒为模板，P1、P2为上下流引物，PCR扩增CA16 VP1基因， PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；4℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共35个循环；72℃ 延伸10 min。1.2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产品进行检测。
1.5 重组表达质粒的构建
将试剂盒收回的PCR产品和表达载体pET21b用BamH I和Hind III双酶切，收回意图基因片段和载体片段，以T4 DNA衔接酶16℃衔接过夜，衔接产品转化到感受态E.coliTOP10中，过夜培育后挑取单克隆菌落，37℃摇菌16 h后提取质粒，用BamH I和Hind III双酶切判定。判定正确的质粒送上海杰李生物技术有限公司测序。
1.6 重组蛋白的表达
将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21（DE3）中，挑取单克隆菌落，接种于2 mL LB（100 μg/mL Amp+15μg/ mL Kana）培育基中，37℃培育7 h，按1%接种量接种到50 mL LB培育基中，37℃、230 rpm振动培育过夜；将50 mL过夜菌液转接至新鲜的450 mL LB中，37℃、230 rpm振动培育至A600为0.6，加IPTG 至终浓度为1 mmol/L，诱导4 h，离心搜集细菌沉积，在冰浴的条件下超声300次，每次超声3 s，距离3 s；离心搜集上清和沉积，进行12% SDS-PAGE剖析。
1.7 重组蛋白的纯化endprint
取重组菌破菌沉积，加8 mol/L（pH8.0）尿素10 mL重悬，4℃裂解过夜；离心搜集上清用于纯化，纯化按Qiagen公司Ni-NTA阐明书进行。12% SDS-PAGE剖析，BandScan软件剖析重组蛋白的纯度。
1.8 小鼠抗CA16病毒血清的制备
将RD细胞接种到培育瓶中，当RD细胞长满80%时，参加CA16病毒悬液，37℃，5%的CO2培育箱中培育4～5 d，搜集细胞并重复冻融三次，离心搜集病毒悬液并腹腔打针5只BALB/c小鼠，病毒剂量按200 μL/只，共打针3次，每次距离2周。第3次打针后1周采血，别离血清。
1.9 直接ELISA法检测重组蛋白的抗原性及有用性
将重组蛋白pET21b-CA16 VP1和pET32a用100 mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）以1：200稀释，别离包被于酶标板100 μL/孔，37℃孵育2 h，弃上清；10%的脱脂奶粉37℃关闭2h；每孔参加2倍系列稀释（1：20～1：5120）的小鼠抗CA16 病毒血清和太原市晚年人血清100 μL，37℃孵育45 min，PBST洗液洗4次；参加1∶2000稀释的辣根过氧化物酶符号的LD5 100 μL，37℃孵育45 min；PBST洗液洗4次，TMB显色液显色，于450 nm波利益测定吸光度值（A450）。
1.10统计学办法
试验数据运用SPSS17.0软件进行统计学剖析，数据契合偏态散布，两组间比较选用两独立样本的秩和查验，P<0.05为差异有统计学含义，选用GraphPad Prism 5软件进行作图剖析。
2 成果
2.1 CA16 VP1 基因的扩增
以pET32a-CA16 VP1质粒为模板，P1、P2为上下流引物，PCR扩增CA16 VP1基因，CA16 VP1基因经1.2%琼脂糖凝胶电泳剖析，可见891bp的特异性条带，巨细与理论值相符，见图1。
2.2 pET21b-CA16 VP1质粒的判定
重组质粒pET21b-CA16 VP1经BamH I和Hind III双酶切，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，可见约5400 bp的载体片段和891 bp的意图基因片段，与理论值相符，见图2。
M：DL2000 Marker ；1：未酶切pET21b-CA16 VP1；
2：pET21b-CA16 VP1双酶切后产品
2.3 CA16 VP1蛋白的表达
将pET21b-CA16 VP1质粒转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中诱导表达，经12% SDS-PAGE检测，成果可见相对分子质量约34KDa的条带，巨细与理论值相符，重组蛋白pET21b-CA16 VP1首要存在于破菌沉积中，以包容体方式表达。经BandScan软件剖析，意图蛋白表达量约占菌体总蛋白的24%，见图3。
2.4 CA16 VP1蛋白的纯化
重组蛋白CA16 VP1经Ni-NTA亲和层析纯化后，12% SDS-PAGE检测，成果可见相对分子质量约34KDa的单一蛋白条带，经BandScan软件剖析，重组蛋白的纯度达90%以上。见图4。
2.5 CA16 VP1的抗原性剖析
5只BALB/c小鼠经CA16病毒4次免疫后，用直接ELISA办法检测纯化的重组蛋白CA16 VP1与倍比稀释的小鼠抗CA16病毒血清的反响性，成果显现，小鼠抗CA16病毒血清可与纯化的重组蛋白特异性结合，A450值随小鼠抗CA16病毒血清浓度的稀释逐步下降，以1∶20～1∶60稀释度下降尤为显着，与pET32a蛋白仅有较弱的结合，见图5。
2.6 CA16 VP1的有用性剖析
95份太原市晚年人血清与重组蛋白CA16 VP1的直接ELISA检测，成果显现：重组蛋白 CA16 VP1与太原市晚年人血清反响的A450（中位数0.912，四分位数距离0.638）显着高于对照组pET32a蛋白与人血清反响的A450（中位数0.486，四分位数距离0.172），差异有统计学含义（P<0.01），见图6。将重组蛋白 CA16 VP1与太原晚年人血清反响的A450值从高到低顺次摆放显现，A450值呈线性散布，呈现高、中、低三种A450值，并且有7例血清的A450值显着高于其他人血清的A450值，见图7。
3 评论
以往研讨以为CA16仅引起细微症状[13]，EV71能引起严峻的并发症及逝世率[14，15]，因而大多数手足口病的研讨首要针对EV71，CA16常被忽视。但是近几年研讨发现，感染CA16的患者也能引起严峻并发症[16]，乃至逝世[17]，CA16日益遭到人们的注重。
本试验构建了重组表达质粒pET21b-CA16 VP1，并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达了CA16 VP1蛋白，SDS-PAGE剖析显现，表达的重组蛋白CA16 VP1首要以包容体方式存在，之所以呈现包容体是因为这些蛋白在体内过量表达，以至于没有满足的时刻正确折叠，二硫键不能正确地配对，过多的蛋白间非特异性结合，蛋白质无法到达满足的溶解度[18]，重组蛋白经Ni柱亲和层析纯化后纯度达90%以上，因为载体蛋白pET21b分子量很小，仅含有27个氨基酸，因而，挑选pET32a载体蛋白作为阴性对照。
为断定重组蛋白CA16 VP1是否具有抗原性，咱们用小鼠抗CA16病毒血清来检测重组蛋白CA16 VP1，成果标明，重组蛋白CA16 VP1与小鼠抗CA16病毒血清的反响显着高于与pET32a蛋白的反响，标明CA16 VP1蛋白具有杰出的抗原性和特异性。本试验成果还显现，在每个血清稀释下，5只小鼠抗CA16病毒血清与重组蛋白CA16 VP1反响的A450值有高有低，而与pET32a蛋白反响的A450值均小于0.5且它们之间的差异很小，标明不同小鼠对相同CA16病毒发作的抗体不同，小鼠之间存在个体差异；小鼠抗CA16病毒血清与pET32a蛋白无结合反响。endprint
为进一步了解重组蛋白CA16 VP1能否有用检测人群中抗CA16 VP1抗体，咱们用表达的重组蛋白CA16 VP1检测太原市晚年人血清，成果标明，重组蛋白CA16 VP1作为抗原能有用检测人群中抗CA16 VP1抗体，有7例血清与重组蛋白存在高的结合反响，标明表达的重组蛋白可以成为一种临床检测用抗原。因为本次试验没有对这7例血清进行中和试验来断定他们是否感染过CA16病毒，有待咱们在后续的试验中进一步验证。
综上所述，本试验成功构建了重组表达质粒pET21b-CA16 VP1，原核表达并纯化了CA16 VP1重组蛋白，能与小鼠抗CA16病毒血清发作特异性反响，能检测出人血清中抗CA16抗体，阐明其具有杰出的抗原性和有用性，本试验为CA16确诊试剂盒的研讨奠定根底。
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（收稿日期：2014-03-13）endprint
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