王宗丽 沈艳玲 张元榛 付金涛 孙立元
[摘要]意图 局灶性脑缺血后发作各种类型的嗜酸性神经元（ENs）。为了评论大鼠局灶性脑缺血后大脑皮质中心区和周边区ENs的形状学特征，及细胞逝世相关因子在ENs中的表达。办法 夹闭蒙古沙鼠单侧颈总动脉制造前脑缺血模型，于3h至2周在显微镜下行ENs形状学和免疫安排化学剖析。成果 光镜：细胞核轻度反常的ENs缺血3h后出现于中心区，12h后出现于周边区，calcium、μ-calpain、GRP78和ubiquitin在该型ENs中呈阳性。中心区，核固缩和胞体不规则萎缩的ENs缺血12h后达峰值，calcium、μ-calpain表达进一步增高；核固缩和胞体极度萎缩的ENs 4d后达峰值，calcium、TUNEL染色呈阳性。周边区，ENs的胞体轻度萎缩，于1周后相继出现核固缩、核碎裂、核溶解，一起calcium、TUNEL染色呈阳性。活化型caspase 3在中心区与周边区的各型ENs中均呈阴性。电镜：中心区，ENs的染色质凝聚成不规则团块状，细胞质中出现很多空胞，核膜及胞膜均决裂。周边区，ENs的染色质凝聚、碎裂呈不规则团块，终究均质化，核膜鸿沟含糊，胞膜仍坚持完好。定论局灶性脑缺血后ENs出现了两种逝世途径：缺血中心区核固缩伴胞体极度萎缩；周边区核溶解伴胞体轻度萎缩。ENs不同形状学的改动与不同细胞逝世相关因子的活化相对应。
[关键词]calpam；嗜酸性神经元；前脑缺血；梗死；蒙古沙鼠
[中图分类号]R364.1 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）11-25-06
局灶性脑缺血导致两种类型的形状学损害：挑选性神经元逝世和梗死。临床和试验数据标明挑选性神经元逝世坐落梗死灶的周边部。嗜酸性神经元（eosinophilic neurons，ENs）是神经细胞缺血性损害的一种方法，呈均匀共同的嗜酸性胞质染色及细胞核固缩、碎裂、溶解，常坐落梗死的周边区。咱们的研讨显现：皮质高密度ENs区域发展为梗死，而低密度ENs区域发展为挑选性神经元逝世。不只ENs的细胞核发作固缩、碎裂、溶解，细胞体也从萎缩发展为肿胀。因而，脑缺血后出现各种形状的ENs，或许反映了不同的缺血程度、时刻经过或细胞逝世机制。
谷氨酸的反常很多开释及其诱发的钙内流是神经元缺血性损害的上游通路，细胞坏死是缺血后细胞逝世的首要机制，而由caspase宗族调控的细胞凋亡也被报导出现在脑缺血模型中。此外，细胞内蛋白质反常降解、依靠ATP的泛素一蛋白酶体功能障碍也或许参加了缺血后神经元逝世。
咱们运用梗死灶呈缓慢发展的沙鼠局灶性脑缺血动物模型，评论局灶性脑缺血后大脑皮质ENs的形状学特征及细胞逝世相关因子在中心区与周边区ENs中的表达。
1资料与办法
1.1一般资料
异氟醚（安耐吉化学）；二乙醚（上海麦克林生化科技有限公司）；多聚甲醛（北京索莱宝生物科技有限公司）；PBS缓冲液（北京雷根生物技术有限公司）；山羊血清（北京索莱宝生物科技有限公司）；茜素红（AMR，Solon，Ohio，USA；1%）；细胞凋亡原位检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；锇酸磷酸盐缓冲液（广州竞赢化工科技有限公司）；柠檬酸铅（安耐吉化学）；乙酸双氧铀（成都麦卡希化工有限公司）；坏死相关蛋白酶抗体—mouseanti-μ-calpain（Chemicon；1：500稀释）；细胞凋亡因子抗体—rabbit anti-actived caspase 3-p17（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA；1：500）；内质网应激蛋白抗体—mouse anti-GRP 78（Santa Cruz Bioteehnology；1：800）；蛋白质降解标志抗体—蛋白质降解标志物抗体—rabbit anti-ubiquitin（Dako Cytomation，Glostrup，DK；1：1000）。
1.2试验动物
雄性蒙古沙鼠87只，16～20周龄，体重（66±6）g，购自三共制药（Sankyo，东京）试验动物中心。试验依照全国卫生研讨所拟定的关爱和运用动物用于研讨的指导方针和校园动物试验委员会的管理条例进行。
1.3试验办法
1.3.1动物模型的制备 2%异氟醚麻醉，切开左颈皮肤，别离左颈动脉用小动脉夹夹闭10min诱发脑缺血。在颈动脉夹闭后进行卒中指数（strokeindex，SI）评分（总分25分），见表1；SI≥10可发展为脑梗死。为削减缺血性损害的个体差异，咱们挑选卒中指数14～17分（n=28）的动物作为“缺血动物”用于后续试验，5h后以相同的处理方法再次使动物缺血10min。两次缺血处理比单次缺血处理动物逝世率低。假手术组（n=4）以相同手术方法处理，但左边颈动脉不夹闭。
1.3.2选材 在缺血后3、6、12、24h，4d，1、2周，动物（每组4只）用二乙醚深度麻醉，4%缓冲多聚甲醛心内灌注固定。脑安排切成3个序列冠状切面：A面（前囟前0.5mm）、B面（前囟后1.5mm）、C面（前囟后3mm）。惯例白腊包埋切片（4μm），HE染色光镜下调查ENs的形状和散布。
1.3.3 ENs的界说 ENs是脑缺血后出现的胞质嗜酸性及细胞核固缩、碎裂、溶解的神经元。缺血急性期部分ENs的细胞核反常伴胞浆嗜酸性，细胞体由肿胀至萎缩、由圆形至不规则。ENs根据形状学特征分为6种类型见表2：核轻度反常和胞体肿胀（图1C、G、H，箭头）；核固缩和胞体不规则萎缩（图1D，箭头）；核固缩和胞体极度萎缩（图1E，箭头）；核固缩和胞体轻度萎缩（图1H、I，楔形箭头）；核碎裂和胞体轻度萎缩（图1I，空白箭头）；核溶解和胞体轻度萎缩（图1T、J，箭头）。
1.3.4形状定量剖析 为了探求ENs在皮层的纵向散布，在前囟前0.5ram，旁2.5、5.7mm的冠状面上界说ROIs区（regions nf interest，ROIs）一与脑皮质外表笔直，宽0.5ram的条形区域（图1B）。与咱们的前期研讨共同，缺血灶中心的正常安排发展为梗死（图1F），而周边的安排发展为挑选性神经元逝世（图1J），且缺血后2周继续存在。光镜（×200）下计数ROIs区的ENs。
1.3.5免疫安排化学染色 HE染色的切片脱色后进行免疫安排化学染色，剖析各型ENs中的细胞逝世相关因子。脱蜡进行HE染色的切片，在显微照片（×400）中记载ROIs区ENs的形状学特征。然后用1%盐酸和80%酒精处理脱去HE染色，进行免疫安排化学染色。
1.3.5.1钙染色 脱去HE染色的切片浸入茜素红处理10min，使积蓄的钙显色。
1.3.5.2 TUNEL染色 用于检测DNA开裂。脱去HE染色的切片用细胞凋亡原位检测试剂盒进行TUNEL染色。切片在蛋白消化酶液中孵育5min，37℃，PBS冲刷，加TdT反响液孵育10min，37℃，PBS冲刷。再滴加3%H2O2室温5min，灭活内源性过氧化物酶。然后加过氧化物酶结合的抗体液，10min，37℃，PBS冲刷，再滴加DAB液室温5min。
未进行HE染色与脱去HE染色的切片作对照以操控HE染色及脱色对免疫安排化学染色的影响。部分切片不加TdT酶进行温箱孵育，作为阴性对照。
1.3.6免疫染色细胞阳性率 经过比较相同ROIs区的HE染色与HE染色脱色后进行免疫安排化学染色的显微照片得到各型ENs免疫染色阳性的百分数，将其分为四种等级：76%～100%为（+++）、51%～75%为（++）、26%～50%为（+）、≤25%为（-）。
1.3.7透射电镜切片制备 假手术组和脑缺血组动物（每组4只）用4%多聚甲醛加5%戊二醛的0.1mol/L的PBS灌注取脑，脑安排浸入灌注液中，作冠状切，从ROIs区获取脑安排样本。用1%锇酸磷酸盐缓冲液固定3h，梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋。制成超薄切片（100nm），柠檬酸铅和乙酸双氧铀染色，透射电子显微镜调查ENs的超微结构特征。
2成果
2.1 ENs的定量剖析
假手术组脑安排未见ENs。缺血中心的ROI区（图1K），核轻度反常和胞体肿胀的ENs缺血3h后出现，6h达峰值，12、24h后削减。核固缩和胞体不规则萎缩的ENs缺血6h后出现，12h达峰值，4d后削减。核固缩和胞体极度萎缩的ENs缺血24h后出现，4d达峰值，1周后削减。该型ENs区域2周后发展为梗死（图1A、F）。缺血周边的ROI区（图1L），核轻度反常和胞体肿胀的ENs缺血12、24h后出现。之后，核固缩、核碎裂、核溶解的ENs缺血24h、4d后相继出现。核固缩、核碎裂的ENs缺血1、2周后削减，而核溶解的ENs进一步增多。
2.2细胞逝世相关因子的表达
首先行HE染色，摄影记载各型ENs，然后脱去HE染色，检测细胞逝世相关因子在各型ENs的表达（表3，图2）。
缺血中心区，核轻度反常和胞体肿胀的ENs表达calcium（64.5±9.4）%、μ-calpain（46.5±8.3）%、GRP 78（78.8±14.4）%、ubiquitin（75.7±11.6）%等细胞逝世相关因子。胞体不规则萎缩的ENs中calcium（91.4±7.2）%、μ-calpain（88.9±10.7）%的表达增高。胞体极度萎缩的ENs中calcium、TUNEL染色的阳性率分别为（73.8±10.2）%、（85.4±7.5）%，而胞体不规则萎缩与胞体极度萎缩的ENs中活化型caspase 3均呈阴性。
周边区，核轻度反常和胞体肿胀的ENs中也表达calcium（60.5±10.7%、GRP78（75.8±12.6%、ubiquitin（70.7±12.7）%等细胞逝世相关因子，但μ-calpain（8.1±4.4）%呈阴性。核固缩、核碎裂的ENs中钙染色的阳性率分别为（64.6±13.1）%、（47.9±13.4）%；TUNEL染色在两种ENs中的阳性率分别为（69.4±8.5）%、（71.6±9.4）%；而caspase 3（2.6±1.8）%、（4.5±3.5）%和μ-calpain（4.5±3.5）%、（3.6±3.3）%在两种ENs中一直呈阴性。
2.3超微结构特征
假手术组神经元的细胞核、线粒体、糙面内质网、高尔基复合体及多聚核糖体的结构明晰，形状均正常（图3A）。
缺血中心区，核固缩和胞体极度萎缩的ENs缺血24h后出现，4d达峰值。缺血1d后可见很多不规则团块状的染色质凝聚，胞质出现很多难以辨认的空胞。缺血4d后核膜（图3B，箭头）及胞膜（图3B，楔形箭头）均决裂。
周边区，核碎裂和胞体轻度萎缩的ENs中可见碎裂、不规则的染色质团（图3C，箭头），胞质密度增高，空胞结构不清，核膜鸿沟含糊，而细胞质坚持完好。核溶解和胞体轻度萎缩的ENs染色质均质化，胞质完好，内有很多空胞（图3D，箭头），部分细胞器残存（图3D，楔形箭头）。
3评论
研讨标明，缺血中心区及周边区神经元的逝世机制呈多样性，这与缺血后神经元不同的形状学改动相关。咱们发现ENs有两种逝世途径：缺血中心区核固缩伴胞体极度萎缩；周边区核溶解伴胞体嗜酸性、轻度萎缩。还发现ENs不同的形状学改动与不同细胞逝世相关因子的活化相对应。缺血后神经元不可逆性损害在光镜下的特征为细胞核固缩、碎裂、溶解伴胞浆红染或失掉对苏木素的亲和力。细胞坏死的两种形状学改动为：核膜及胞膜决裂；核溶解而胞膜完好。缺血急性期ENs胞体萎缩、嗜酸性伴核固缩，晚期细胞核失掉对苏木素的亲和力伴胞浆轻度红染（鬼影细胞）。这些发现与咱们调查到的ENs核固缩伴胞体萎缩仅见于缺血中心区相共同。核轻度反常和胞体肿胀的ENs是中心区或周边区最早出现的ENs。“肿胀细胞”具有相似的形状学改动：胞体肿胀、核正常而染色质呈不规则团块状，曩昔的研讨称之为“尼氏体溶解”。这些改动多见于急性期，如大鼠脑缺氧缺血后3～4h。
各型ENs出现的时序性显现细胞从一种形状发展到另一种形状。中心区核固缩和胞体不规则萎缩的ENs迟于核轻度反常和胞体肿胀的ENs出现，且calcium、μ-calpain表达进一步增高，之后出现的核固缩和胞体极度萎缩的ENs呈TUNEL染色阳性，这或许是损害安排发展为梗死前的终究改动。周边区ENs在GRP78、ubiquitin染色呈阳性，细胞内蛋白质反常降解、依靠ATP的泛素-蛋白酶体功能障碍或许参加了缺血后周边区ENs逝世。
在周边区，许多研讨根据活化型caspase 3、TUNEL染色阳性估测缺血神经元逝世的首要机制为细胞凋亡。咱们的成果显现大部分ENs在活化型caspase 3染色呈阴性（表3，图2E、E），而咱们运用的抗体检测caspase 3的p17亚基，可区别细胞凋亡与非细胞凋亡。咱们的成果标明caspase 3依靠的细胞凋亡途径或许不是周边区ENs逝世的首要机制。近期研讨标明活化型caspase 3在老练缺血脑安排中呈阴性，在未老练大脑中呈阳性。此外，在缺血中心区与周边区多型ENs出现TUNEL阳性，因为细胞坏死的最终阶段发作DNA开裂，TUNEL染色也或许阳性，所以呈TUNEL染色阳性的ENs不能证明必定发作细胞凋亡。
神经元坏死有两种超微形状学特征：细胞核肿胀、溶解，细胞膜决裂内容物流出；细胞器肿胀，细胞萎缩。咱们的研讨显现，在缺血中心区，神经元变性的最终阶段是核固缩和胞体极度萎缩的ENs，兼具两种坏死的特色：染色质凝聚、碎裂伴细胞膜决裂。在周边区，核固缩、核碎裂伴胞体轻度萎缩的ENs在HE染色凋亡样改动，且TUNEL染色也呈阳性，电镜下进一步可见凝聚、不规则的染色质团。但定量剖析标明核溶解和胞体轻度萎缩的ENs是周边区神经元逝世的最终阶段。有前期研讨提出，细胞逝世或许存在一个从凋亡（前期损害）到坏死（晚期损害）的进程。本研讨成果提示，缺血周边区ENs的逝世途径是从凋亡到坏死。
总归，本研讨标明，局灶性脑缺血后ENs有两种逝世途径：缺血中心区核固缩伴胞体极度萎缩；周边区核溶解伴胞体轻度萎缩。ENs不同形状学的改动与不同细胞逝世相关因子的活化相对应。
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