梁泽智++黄洁平
[摘要]意图 评论虫草素（Cordycepin）对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞p38MAPK通路及TGF-β1表达的影响。办法 体外培育大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞株），分为正常对照组（NG组）、高糖组（HG组）、高糖+虫草素组（HG+C组）。运用定量RT-PCR测定NRK52E p38MAPK及TGF-β1 mRNA的表达；选用Western印迹办法检测不一起刻点p-p38MAPK、TGF-β1蛋白的表达水平。成果 与NG组比较，HG组NRK52E细胞的p38MAPK、TGF-β1 mRNA表达增多（P<0.01）；p-p38MAPK蛋白、TGF-β1蛋白表达与mRNA表达趋势一起（P<0.05）；而虫草素能够显着按捺高糖介导的NRK52E细胞p38MAPK的活化及TGF-β1的表达。定论 虫草素能够按捺高糖介导大鼠肾小管上皮细胞p38MAPK活化及TGF-β1表达。
[关键词]p38MAPK；虫草素；TGF-β1；葡萄糖
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）06（b）-0004-04
[Abstract]Objective To investigate effect of cordycepin on p38MAPK pathway and TGF-β1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose.Methods NRK52E cells were cultured in the mediun with normal glucose concentration （group NG），high glucose concentration （group HG） and high glucose concentration+cordycepin （group HG+C）.The expression of p38MAPK and TGF-β1 mRNA was measured by quantitative RT-PCR；the expression level of p-p38MAPK and TGF-β1 protein was detected by Western blot.Results The p38MAPK and TGF-β1 mRNA in NRK52E cells were highly expressed in group HG compared with group NG （P<0.01）；the tendency of p-p38MAPK and TGF-β1 protein expressed was accordance with expression of mRNA.However，cordycepin can significantly inhibit the activation of p38MAPK pathway and TGF-β1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose.Conclusion Cordycepin can significantly inhibit the activation of p38MAPK pathway and TGF-β1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose.
[Key words]P38MAPK；Cordycepin；TGF-β1；Glucose
糖尿病腎病（diabetc nephropathy，DN）是导致终晚期肾病（end-stage renal disease，ESRD）最常见的原因之一[1]，小管间质纤维化是其重要的临床表现[2]。多种要素参加了糖尿病肾病的发作及开展[3]，包含高糖、细胞通路的激活[4]等。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是MAPK宗族的一个亚族，可被高糖等要素激活，激活后可经过上调TGF-β/Smad等多条信号转导途径[5]终究导致了肾小球的纤维化[6]。TGF-β1是公认的致纤维化因子，在肾纤维化过程中发挥重要效果。研讨发现，TGF-β1和p38MAPK存在彼此串话[7]，一起导致了肾脏的纤维化。虫草素是我国贵重草药冬虫夏草的主要成分之一，在肾脏中具有重要维护效果，可是机制没有清晰，本试验经过体外培育NRK52E细胞，调查虫草素对高糖介导的NRK52E细胞p38MAPK通路及TGF-β1表达的影响，评论虫草素对肾脏维护效果的机制。
1材料与办法
1.1材料
1.1.1试剂 NRK52E细胞（肾小管上皮细胞，中山大学余学清教授惠赠），虫草素（Sigma公司，货号：C3394-10MG），葡萄糖（Sigma公司，货号：G7021-100G），TRizol试剂（Invitrogen公司，货号：15596026），逆转录试剂盒（SuperScriptRⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR kits，Invitrogen公司），PCR扩增试剂盒（SYBRRSelect Master Mix，Invitrogen公司），胎牛血清（美国Gibco BRL，货号：16000-044），兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗体（英国New England Biolabs），小鼠抗大鼠TGF-β1单克隆抗体（美国Abcam）等。
1.1.2仪器设备 恒温CO2细胞培育箱：美国Thermo公司；倒置荧光显微镜：美国AXJOVERT公司；PCR扩增仪PCT-200：美国Thermo公司；荧光定量PCR仪：Applied Biosystems；超微量分光光度计 NANODROP-2000：美国Thermo公司；显微镜及成像系统：OLYMPUS BX51；凝胶成像系统：法国BIO-UISON100；超声波细胞破坏仪：SCIENTZ公司；定量酶标仪：美国MRX2；电泳仪：美国Bio-RAD公司。
1.2办法
1.2.1细胞培育及分组 用低糖DEME彻底培育基（含10%胎牛血清）培育细胞，待细胞贴壁60%～80%，改用无血清培育基进行同步培育，将细胞依照规划进行分组并参加不同浓度葡萄糖：正常对照组（5.5 mmol/L）、高糖组（30 mmol/L）、高糖+虫草素组（30 mmol/L，虫草素浓度10 μg/ml），高糖+虫草素组运用虫草素进行预先干涉2 h。
1.2.2 qRT-PCR 待细胞培育满足时刻，搜集细胞，提取细胞的总RNA。然后对RNA进行OD值及浓度测定。取1 μg的总RNA依照试剂盒说明书的办法进行组成cDNA，然后再对逆转录产品进行扩增。选用primer 5.0软件规划意图基因引物序列，由北京华大基因公司组成，所得引物用DEPC水稀释后放于-20℃备用，各基因引物序列见表1。反响系统：SYBR 10 μl；Forward 0.16 μl；Reverse 0.16 μl；ddH2O 4.68 μl；cDNA 5 μl；反响条件及过程：①预变性：采纳95℃进行2 min；②变性：95℃的温度进行15 s；③退火：58℃进行30 s；④延伸：72℃延伸30 s；⑤循环：一共经过40个循环，再充沛延伸10 min。将所组成的目标（p38MAPK、TGF-β1）与内参（GAPDH）的Ct值采纳取对数的办法进行比较，其比值标明待测目标的mRNA的相对表达量。
1.2.3 Western blot 按规划分组培育细胞并参加不同的影响，15 min、30 min、60 min、12 h、24 h、48 h后，搜集细胞，提取细胞总蛋白，进行超声破碎，接着选用BCA定量法对蛋白进行测定其浓度。选用8% SDS-PAGE别离胶上样，电泳时先选用80 V，待样品蛋白抵达别离胶后，改成120 V，继之在340 mA下转膜2.5～3 h，运用5%脱脂牛奶关闭2 h，一抗选用浓度为：（p-p38MAPK，1∶3000；TGF-β1，1∶2000）过夜，运用脱脂牛奶洗刷加二抗（1∶5000～1∶10 000），暗室曝光、显影，终究进行灰度剖析。
1.3统计学办法
选用SPSS 17.0统计学软件进行数据剖析，计量材料数据用均数±标准差（x±s）标明，多组间比较选用单要素方差剖析，组间两两比较选用LSD-t查验；以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1不一起刻点NRK52E细胞的p38MAPK mRNA表达状况
高糖影响后，不一起刻点的p38MAPK mRNA的表达显着升高，并且在15 min、24 h两个时刻段呈现顶峰；高糖+虫草素组的p38MAPK mRNA表达较高糖组显着下降，较正常对照组升高（P<0.01）（图1）。
2.2不一起刻点NRK52E細胞的TGF-β1 mRNA表达状况
在高糖的影响下，不一起刻点的TGF-β1 mRNA的表达显着升高，并且在呈时刻依靠性添加；高糖+虫草素组的TGF-β1 mRNA较高糖组显着下降，较正常对照组升高（P<0.01）（图2）。
2.3不一起刻点p38MAPK蛋白的表达状况
在高糖的影响下，不一起刻点的p-p38MAPK蛋白的表达显着升高，并且在15 min、24 h两个时刻段呈现顶峰；高糖+虫草素组的p-p38MAPK蛋白表达较高糖组显着下降，较正常对照组升高（P<0.01）（图3）。
2.4不一起刻点NRK52E细胞的TGF-β1蛋白表达状况
在高糖的影响下，不一起刻点的TGF-β1蛋白的表达呈时刻依靠性地升高；高糖+虫草素组的TGF-β1蛋白表达较高糖组显着下降，较正常对照组显着升高（P<0.01）（图4）。
3评论
糖尿病肾病是以肾小球系膜细胞增殖、肥壮以及细胞外基质过度积累，终究导致肾脏纤维化。多种要素及细胞通路参加糖尿病肾病肾脏纤维化的发作及开展，包含TGF-β/Smad通路、p38MAPK通路[8]等。
TGF-β是公认的导致肾脏细胞外基质（ECM）堆积和纤维化的最重要的因子，在糖尿病肾病患者的开展中起着核心效果[9]。Zeisberg等[10]研讨发现，TGF-β1影响后，人近端肾小管上皮细胞失掉上皮细胞表型E-cadherin，获得了肌成纤维细胞的表型α-SMA，并导致了细胞外基质成分发作添加。有研讨标明，在糖尿病肾病中，TGF-β能够经过激活TGF-β依靠的Smad信号通路，也能够激活非TGF-β依靠的信号通路，如p38MAPK，终究促进ECM的组成、EMT的发作[11-12]，终究引发肾间质纤维化。
p38MAPK是各种细胞外信号影响细胞内信号传递的一起通路，它能够被多种要素激活。Lv等[13]发现，高糖能够导致肾小管上皮细胞p38MAPK通路的激活，参加了EMT的发作；在糖尿病肾病中，p38MAPK 的活化能够直接调理α-SMA蛋白的组成[14]，一起刻接的活化Smad通路，参加了TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT的发作[15]。Tzeng等[16]用乙醇提取的金银花能够按捺p38 MAPK的活化延缓了STZ诱导的糖尿病肾病的发作及开展。
冬虫夏草是我国传统的贵重中草药，具有“益肺肾﹑补精华”之成效。虫草素是从其别离出来的单体，是一种核苷类似物。周巧玲等[17-18]的研讨发现，冬虫夏草可下调糖尿病肾病肾安排TGF-β1、CTGF及Ⅳ型胶原的表达，减轻糖尿病肾病肾纤维化。除此外虫草素还能够按捺嘌呤组成，诱导凋亡，引起细胞周期阻滞、削减炎症介质开释等药理效果[19-20]。
本试验研讨显现，高糖介导下，不一起刻点的p38MAPK、TGF-β1 mRNA及蛋白表达均显着增高，虫草素干涉后，高糖介导下的p38MAPK、TGF-β1 mRNA及其蛋白高表达均显着下调，提示虫草素能够按捺高糖介导大鼠肾小管上皮细胞p38MAPK通路活化及TGF-β1表达。因而，本研讨估测，虫草素可能经过按捺p38MAPK通路活化然后下调TGF-β/Smad信号转导，减轻糖尿病肾病肾脏纤维化。本研讨组下一步将检测虫草素对p38MAPK、TGF-β/Smad通路活化后下流相关蛋白的表达的影响，清晰虫草素对糖尿病肾病防治机制，为糖尿病肾病的医治供给新的知道和理论依据。
[參考文献]
[1]Nazir N，Siddiqui K，Al-Qasim S，et al.Meta-analysis of diabetic nephropathy associated genetic variants in inflammation and angiogenesis involved in different biochemical pathways[J].BMC Med Genet，2014，15（1）：103.
[2]Sasai Y，Iwakawa K，Yanagida K，et al.Advanced glycation endproducts stimulate renal epithelial cells to release chem-okines that recruit macrophages，leading to renal fibrosis[J].Biosci Biotechnol Biochem，2012，76（9）：1741-1745.
[3]Goldberg R，Rubinstein AM，Gil N，et al.Role of heparanase-driven inflammatory cascade in pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Diabetes，2014，63（12）：4302-4313.
[4]Marketou NP，Chrousos GP，Kanaka-Gantenbein C.Diabetic nephropathy in type 1 diabetes：a review of early natural history，pathogenesis and diagnosis[J].Diabetes Metab Res Rev，2016.
[5]Rane MJ，Song Y，Jin S，et al.Interplay between Akt and p38 MAPK pathways in the regulation of renal tubular cell apoptosis associated with diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol，2010，298（1）：F49-F61.
[6]Li X，Liu W，Wang Q，et al.Emodin suppresses cell proliferation and fibronectin expression via p38MAPK pathway in rat mesangial cells cultured under high glucose[J].Mol Cell Endocrinol，2009，307（1）：157-162.
[7]Xu Q，Tan Y，Zhang K，et al.Crosstalk between p38 and Smad3 through TGF-β1 in JEG-3 choriocarcinoma cells[J].Int J Oncol，2013，43（4）：1187-1193.
[8]Kanasaki K，Taduri G，Koya D.Diabetic nephropathy：the role of inflammation in fibroblast activation and kidney fibrosis[J].Front Endocrinol，2013，4（1）：7.
[9]Chung ACK，Lan HY.Molecular mechanisms of TGF-β signaling in renal fibrosis[J].Curr Pathobiol Rep，2013，1（4）：291-299.
[10]Zeisberg M，Hanai J，Sugimoto H，et al.BMP-7 counteracts TGF-β1–induced epithelial-to-mesenchymal transition and reverses chronic renal injury[J].Nat Med，2003，9（7）：964-968.
[11]Lan HY.Diverse roles of TGF-beta/Smads in renal fibrosis and inflammation[J].Int J Biol Sci，2011，7（7）：1056-1067.
[12]Meng XM，Chung ACK，Lan HY.Role of the TGF-β/BMP-7/Smad pathways in renal diseases[J].Clin Sci （Lond），2013， 124（4）：243-254.
[13]Lv ZM，Wang Q，Wan Q，et al.The role of the p38 MAPK signaling pathway in high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition of cultured human renal tubular epithelial cells[J].PLoS One，2011，6（7）：e22806.
[14]Lan HY.Transforming growth factor-β/Smad signalling in diabetic nephropathy[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2012， 39（8）：731-738.
[15]Rhyu DY，Yang Y，Ha H，et al.Role of reactive oxygen species in TGF-β1-induced mitogen-activated protein kinase activation and epithelial-mesenchymal transition in renal tubular epithelial cells[J].J Am Soc Nephrol，2005，16（3）：667-675.
[16]Tzeng TF，Liou SS，Chang CJ，et al.The ethanol extract of Lonicera japonica （Japanese honeysuckle） attenuates diabetic nephropathy by inhibiting p-38 MAPK activity in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Planta Med，2014，80（2/3）：121-129.
[17]周巧玲，劉抗寒，王衍慧，等.冬虫夏草对糖尿病肾病模型鼠肾安排转化生长因子B1，结缔安排生长因子表达的影响[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2006，15（5）：443-446.
[18]叶太生，周必发，张莹雯.百令胶囊对大鼠肾小球系膜细胞增殖，Ⅳ型胶原及TGF-β1 mRNA表达的影响[J].我国中西医结合肾病杂志，2010，11（1）：41-43.
[19]Baik JS，Kwon HY，Kim KS.Cordycepin induces apoptosis in human neuroblastoma SK-N-BE （2）-C and melanoma SK-MEL-2 cells[J].Indian J Biochem Biophys，2012，49（2）：86-91.
[20]Cui J，Culbertson R，Mao Z，et al.A novel therapeutic treatment utilizing cordycepin and cladribine synergy to decrease adverse treatment effects in various cancer cell lines[J].JESS，2013，2：20-24.
（收稿日期：2017-04-25 本文修改：任 念）
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