米洋 原小斌 张彬 王东文 张旭辉
[摘要] 意图 探討2型糖尿病胰岛素反抗大鼠前列腺微血管重生与良性前列腺增生症发作开展的联系。 办法 ①正常对照组大鼠（Normal组，n=15）：8～10周龄正常雄性Wistar大鼠；②单纯良性前列腺增生组大鼠（BPH组，n=15）：手术去势后外源性给予高剂量雄激素；③胰岛素反抗前列腺增生组大鼠（GK+BPH组，n=15）：8～10周龄自发型非肥胖型2型糖尿病Wistar大鼠（GK大鼠），手术去势后外源性给予高剂量雄激素；④胰岛素反抗前列腺增生血糖干涉组大鼠（GK+BPH+PH组，n=15）：8～10周龄GK大鼠手术去势后外源性给予高剂量雄激素，一起给予盐酸吡格列酮灌胃。光化学法检测大鼠空腹血糖水平；ELISA双抗体夹心法检测大鼠血清胰岛素水平及前列腺DHT含量；real-time PCR法检测大鼠前列腺VEGF、Ang-1、Ang-2 mRNA表达量；免疫组化S-P法检测前列腺安排CD31表达并依据阳性成果计数MVD。 成果 ①GK+BPH、GK+BPH+PH组空腹血糖水平及胰岛素反抗指数高于Normal组及BPH组（P<0.05）；GK+BPH组目标高于GK+BPH+PH组（P<0.05）；Normal组及BPH组上述目标差异无计算学含义（P>0.05）。BPH组、GK+BPH组、GK+BPH+PH组前列腺安排中DHT含量与Normal组比较显着增高（P<0.05）；GK+BPH组、GK+BPH+PH组高于BPH组，且GK+BPH组高于GK+BPH+PH组（P<0.05）；②各组前列腺安排中VEGF、Ang-1、Ang-2 mRNA表达量及MVD计数成果为GK+BPH组>GK+BPH+PH组>BPH组>Normal组，组间差异有计算学含义（P<0.05）；③GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺安排中DHT含量与胰岛素反抗指数呈正相关（P<0.05），相关性显着。 定论 2型糖尿病伴胰岛素反抗时，可经过添加前列腺安排DHT的含量然后上调VEGF、Ang-1、Ang-2的表达，促进前列腺安排部分血管重生以加快良性前列腺增生症的开展。
[关键词] 胰岛素反抗；前列腺增生症；血管内皮成长因子；血管生成素；微血管密度
[中图分类号] R691.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）08-0035-05
Experiment of microvascular angiogenesis of prostate in rats with insulin resistance
MI Yang1 YUAN Xiaobin2 ZHANG Bin2 WANG Dongwen2 ZHANG Xuhui2
1.First School of Clinical Medicine of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China； 2.Department of Urology， First Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China
[Abstract] Objective To investigate the association between the microvascular angiogenesis and the occurrence and progress of benign prostatic hyperplasia（BPH） in type-2 diabetic rats with insulin resistance（IR）. Methods ①Rats of normal group（n=15）： normal male Wistar rats aged 8 to 10 weeks. ②Rats of BPH group（n=15）： high-dose exogenous androgen was given after surgical castration. ③Rats with IR and BPH（GK+BPH） group（n=15）： high-dose exogenous androgen was given to spontaneous non-obese type-2 diabetic Wistar rats（GK rats） aged 8 to 10 weeks. ④Rats of IR and BPH with blood glucose intervened（GK+BPH+PH） group（n=15）： high-dose exogenous androgen was given to GK rats aged 8 to 10 weeks and pioglitazone hydrochloride was given by intragastric administration. The level of fasting blood glucose in rats was assessed by photochemical method. The levels of serum insulin and DHT in prostate of rats were assessed by double antibody sandwich ELISA. The expression of VEGF， Ang-1 and Ang-2 in prostate of rats was assessed by real-time. The expression of CD31 in prostate tissue was assessed by the S-P immunohistochemical method and MVD was counted based on the positive results. Results ①The level of fasting blood glucose and the IR index in GK+BPH group and GK+BPH+PH group were higher than those in normal group and BPH group（P<0.05）. Those in GK+BPH group were higher than GK+BPH+PH group（P<0.05） while there was no statistical difference between normal group and BPH group（P>0.05）. The level of DHT in the prostate tissue of BPH group， GK+BPH group and GK+BPH+PH group was higher than that in normal group（P<0.05）. That in GK+BPH group and GK+BPH+PH group was higher than BPH group and that in GK+BPH group was higher than GK+BPH+PH group（P<0.05）. ②The levels of mRNA of VEGF， Ang-1 and Ang-2 and the MVD count were： GK+BPH group>GK+BPH+PH group>BPH group>Normal group， with statistical differences between each other（P<0.05）. ③The level of DHT in the prostate tissue of GK+BPH group and GK+BPH+PH group was significantly and positively associated with the IR index（P<0.05）. Conclusion When IR occurred in type-2 diabetes， the level of DHT in prostate tissue could be increased to up-regulate the expression of VEGF， Ang-1 and Ang-2 and promote the microvascular angiogenesis in prostate tissue so as to accelerate the progress of benign prostatic hyperplasia.
[Key words] Insulin resistance； Prostatic hyperplasia； Vascular endothelial growth factor； Angiogenin； Microvessel density
雄激素是前列腺安排中重要的激素，现在研讨以为其与良性前列腺增生症（benign prostatic hyperplasia，BPH）的发作开展密不可分[1]。前列腺血管内皮细胞是雄激素在前列腺安排中发挥生物学效应的首要靶点之一[2，3]，前列腺增生腺体中的血管过度生成可能与腺体的增生密切相关[4]。相关研讨已证明，2型糖尿病兼并胰岛素反抗（insulin resistance，IR）患者前列腺成长速度及前列腺体积与单纯BPH患者比较显着增高，但其详细机制没有清晰[5]。本研讨经过构建2型糖尿病胰岛素反抗兼并BPH及单纯BPH大鼠模型，比较各模型组与正常大鼠前列腺安排中（dihydrotestosterone，DHT）、血管生成素-1（Angiopoietin-1，Ang-1）、血管生成素-2（Angiopoietin-2，Ang-2）、血管内皮成长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及微血管密度（microvessel density，MVD）计数差异，评论2型糖尿病胰岛素反抗与BPH发作开展的相关性。
1材料与办法
1.1 试验动物及养殖条件
2型糖尿病胰岛素反抗大鼠模型：运用8～10周龄，体重250～300 g，SPF级雄性非胰岛素依靠型非肥胖型2型糖尿病Wistar大鼠（GK大鼠），购自于江苏省常州市卡文斯试验动物有限公司，许可证号SCXK（苏）2011-003；其他各组选用同周龄SPF级雄性Wistar大鼠，购自于山西医科大学动物试验中心，许可证号：SYXK（晋）2003-013。一切大鼠均养殖于山西医科大学动物试验中心SPF级试验室，规范化养殖房喂食，饲喂规范颗粒饲料，自在饮水。养殖环境：T 18℃～22℃，H 50%～70%，日照时间为8：00-20：00。
1.2 首要试剂
盐酸吡格列酮（Sigma公司，PHR1632）；丙酸睾酮（Sigma公司，BP720）；苯甲酸雌二醇（Sigma公司，E8875）；大鼠胰岛素ELISA定量试剂盒（Thermo Fisher公司，ERINS）；大鼠DHT ELISA定量试剂盒（IBL公司，DB52021）；兔抗大鼠CD31单克隆抗体（R&D;公司，AF3628）；Real-time RT PCR试剂盒（Takara公司，RR037A）；罗氏生机型微量血糖仪及试纸。
1.3 办法
1.3.1 单纯BPH大鼠造模 8～10周龄Wistar大鼠行去势手术，术前8 h禁食，不由水，取阴囊正中约1.5 cm横切断，别离游离左、右侧精索，自附睾头部近端结扎精索，切除双侧睾丸及附睾后还纳精索残端，逐层缝合切断。术后第3天起，每日皮下注射丙酸睾酮 3 mg/kg，苯甲酸雌二醇0.03 mg/kg，4周后诱导成模。
1.3.2 胰岛素反抗兼并BPH造模 8～10周龄GK大鼠随机验证空腹血糖≥8.0 mmol/L后，依照上述1.3.1中办法诱导BPH模型。
1.3.3 胰岛素反抗兼并BPH血糖干涉组造模 8～10周龄GK大鼠随机验证空腹血糖≥8.0 mmol/L后，经口灌胃给予盐酸吡格列酮20 mg/（kg·d），并随即检测空腹血糖安稳≤6.5 mmol后，依照上述1.3.1中办法诱导BPH模型。
1.3.4 试验分组及给药办法 ①正常对照组大鼠（Normal组，n=15）：8～10周龄正常雄性Wistar大鼠；②单纯良性前列腺增生组大鼠（BPH组，n=15）：手术去势后外源性给予高剂量雄激素；③胰岛素反抗前列腺增生组大鼠（GK+BPH组，n=15）：8～10周龄自发型非肥胖型2型糖尿病Wistar大鼠（GK大鼠），手术去势后外源性给予高剂量雄激素；④胰岛素反抗前列腺增生血糖干涉组大鼠（GK+BPH+PH组，n=15）：8～10周龄GK大鼠给予盐酸吡格列酮灌胃，一起行手术去势后外源性给予高剂量雄激素。
1.4 调查目标及办法
（1）大鼠空腹血糖测定：禁食8 h后鼠尾尖断尾采血，运用微量血糖仪测定。（2）胰岛素反抗指数（HOMA-IR）测定：选用鼠尾静脉取血，1000×g离心10 min后汲取上清，依照大鼠胰岛素ELISA定量试剂盒说明书操作，于450 nm波长下测定各规范品及样品吸光光度值，依据规范曲线及样品所测得的OD值，计算出相应Insulin含量。HOMA-IR=空腹血糖（FGP，mmol/L）×空腹胰岛素（FINS，mL U/L）/22.5。（3）大鼠前列腺安排中DHT测定：前列腺安排100 mg经液氮冷冻，参加1 mL 0.9% NaCl生理盐水，1000×g离心10 min后汲取上清，按大鼠DHT ELISA定量试剂盒说明书操作，于450 nm波长下测定各规范品及样品吸光光度值，依据规范曲线及样品所测得的OD值，计算出相应样本DHT含量。（4）大鼠前列腺安排Ang-1、Ang-2、VEGF检测：前列腺安排约100 mg，经液氮冷冻后研磨，参加1 mL Trizol提取总RNA，严厉按试剂盒说明书办法首要反转录组成cDNA，经过SYBR Premix Ex TaqⅡ实时荧光定量PCR检测Ang-1、Ang-2、VEGF的表达，大鼠β-actin作为内参，运用ABI 7500荧光定量PCR进行检测。反响条件如下：①反转录 37℃ 15 min→85℃ 5 s→4℃；②Real time PCR stage 1预变性cycle 1 95℃ 30 s；stage 2 PCR反响cycle 40 95℃ 5 s→60℃ 30 s。real-time PCR引物见表1。（5）前列腺CD31检测并依据阳性成果计数MVD值：前列腺安排经10%中性福尔马林固定，脱水后白腊包埋后切片，石蠟切片经脱蜡、复水后选用SP法免疫组化染色，3%过氧化氢浸泡10 min，山羊血清室温关闭10 min，加一抗CD31单克隆抗体4℃过夜孵育，加二抗及辣根过氧化物酶37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染。各过程间运用PBS冲刷，阴性对照运用PBS作为一抗。前列腺间质区成棕黄色染色的单个内皮细胞或内皮细胞簇，均作为一个血管计数，肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞直经的血管不计数；每张染色切片首要在100倍视界下挑选3个血管最多的前列腺间质区，这以后在200倍视界下以CD31阳性表达血管成果进行MVD计数。每例标本别离随机计数5个视界，取平均值。
1.5 计算学办法
计算软件选用SPSS 22.0计算软件包，计量材料以（x±s）标明，各组之间比较选用单因素方差剖析，选用Pearson相关性剖析，P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 各组大鼠空腹血糖水平、胰岛素反抗指数、前列腺安排DHT含量比较
与Normal组比较，GK+BPH组、GK+BPH+PH组空腹血糖水平比较显着增高（P<0.05），与BPH组空腹血糖水平比较差异不显着（P>0.05）；与GK+BPH组比较，GK+BPH+PH组空腹血糖水平下降（P<0.05）。
与Normal组比较，GK+BPH组、GK+BPH+PH组胰岛素反抗指数显着升高，差异有计算学含义（P<0.05），与BPH组胰岛素反抗指数比较差异不显着，差异无计算学含义（P>0.05）；与GK+BPH组比较，GK+BPH+PH组胰岛素反抗指数下降，差异有计算学含义（P<0.05）。
与Normal组比较，BPH组、GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺安排中DHT含量显着增高，差异有计算学含义（P<0.05）；与BPH组比较，GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺安排中DHT含量增高，差异有计算学含义（P<0.05）；与GK+BPH组比较，GK+BPH+PH组大鼠前列腺安排中DHT值下降，差异有计算学含义（P<0.05）。见表2。
2.2各组前列腺安排Ang-1、Ang-2、VEGF mRNA的表达及MVD计数比较
与Normal组比较，BPH组、GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺安排中Ang-1、Ang-2、VEGF mRNA的表达均显着增高，差异有计算学含义（P<0.05）；与BPH组比较，GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺安排中Ang-1、Ang-2、VEGF mRNA的表达增高，差异有计算学含义（P<0.05）；与GK+BPH组比较，GK+BPH+PH组大鼠前列腺安排中上述三项目标的表达下降，差异有计算学含义（P<0.05）。
CD31首要表达于前列腺间质中血管内皮细胞膜及胞浆，表现为棕黄色颗粒。前列腺间质中各部分微血管管腔巨细、散布密度差异性显着，以CD31阳性表达血管成果计数MVD（图1）。与Normal组比较，BPH组、GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺安排中MVD值显着增高，差异有计算学含义（P<0.05）；与BPH组比较，GK+BPH组、GK+BPH+PH组大鼠前列腺安排中MVD值增高，差异有计算学含义（P<0.05）；与GK+BPH组比较，GK+BPH+PH组大鼠前列腺安排中MVD值下降，差异有计算学含义（P<0.05）。见表3。
2.3大鼠胰岛素反抗指数与DHT含量相关性剖析
GK+BPH组大鼠胰岛素反抗指数与DHT含量呈正相关，Pearson相联系数为0.716（P=0.014<0.05），相关性显着；GK+BPH+PH组大鼠胰岛素反抗指数与DHT含量呈正相关，Pearson系数为0.737（P=0.002<0.05），相关性显着。
3 评论
良性前列腺增生症（benign prostate hyperplasia，BPH）是我国中老年男性人群中常见的疾病，与之相关联呈现的下尿路症状（lower urinary tract symptom，LUTS）包含尿频、尿急、尿流细线、夜尿增多等症状，严重影响着中老年患者的日子质量[6]。一起，跟着近年来我国人群日子、饮食习惯的改动，2型糖尿病在我国中老年人群已成盛行趋势[7]。相关临床研讨发现，在兼并有2型糖尿病胰岛素反抗的BPH患者中，其前列腺体积增长速度高于单纯患BPH的患者[5]，但其机制现在尚不清晰。在哺乳动物体内，雄性个体内的睾酮经过5α还原酶效果，转化为其活性方式——双氢睾酮（DHT），进而影响前列腺安排的增生。Vikram[4]及Nandeesha等[8]以为胰岛素反抗大鼠前列腺体积显着增大可能与前列腺安排中雄激素表达量增高然后促进BPH的发作开展密切相关。
雄激素在前列腺安排中发挥多种生物学效应，研讨标明雄激素对前列腺血管内皮成长的促进效果是其在前列腺安排中所发挥的首要效果之一[9]。前列腺中血管內皮细胞对雄激素浓度改变极为灵敏，予大鼠行去势手术后，可调查到前列腺安排中血管内皮细胞早于前列腺上皮呈现凋亡[10，11]，外源性给予雄激素后，24 h内即可调查到前列腺血管内皮细胞的再生[2]。但是，雄激素并非直接促进前列腺血管内皮细胞的增殖，是经过调理血管内皮细胞或其他基质细胞所表达的血管相关成长因子含量，然后完成调控血管内皮细胞增殖[12]。
血管内皮成长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种强效的内皮细胞成长调控因子，可促进血管生成，现有研讨已证明VEGF在前列腺的表达受雄激素含量改变的直接调控[13]。血管生成素（Angiopoietin，Ang）对诱导血管重生及安稳重生血管起重要效果，Ang-1与Ang-2具有相同受体Tie-2，Ang-1与受体结合后可引起重生血管结构重塑，下降重生血管通透性，安稳重生血管结构；Ang-2竞争性结合Tie-2受体后，可损坏血管内皮细胞-基质细胞-滑润肌细胞间的平衡，添加血管通透性，对立Ang-1的血管安稳效应，促进血管重生[14，15]。Guimin Wang等[9]研讨证明，雄激素经过调控前列腺安排中Ang-1、Ang-2的表达，然后上调VEGF的表达量，促进前列腺安排中血管的生成。MVD计数是现在公认点评血管生成的目标，经过运用血管内皮某些成分的单克隆抗体标记，如CD31、CD34等，进行免疫组化染色，可显现安排中的微血管，便于MVD计数。
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